我对H3F3A这个基因做了两个突变的cellline，分别是G34V和K27M，现在知道这个基因在hg38上面的坐标是：

Genomic Location for H3F3A Gene
Chromosome:  1
Start:226,061,851 bp from pter  End:226,072,002 bp from pter
Size:10,152 bases    Orientation:Plus strand

然后我用samtools结合bcftools把该基因区域的snp位点call出来：

samtools mpileup -r chr1:226061851-226072001 -t "DP4" -ugf ~/reference/genome/hg38/hg38.fa  *sorted.bam | bcftools call -vmO z -o  H3F3A.vcf.gz

但是得到的vcf只有DP4和染色体起始终止坐标坐标信息，我并不知道该坐标是蛋白质的第几个位点，所以需要注释，我首先想到的就是ANNOVAR啦，毕竟用了它很久。

~/biosoft/ANNOVAR/annovar/convert2annovar.pl -format vcf4old H3F3A.vcf >tmp.annovar
~/biosoft/ANNOVAR/annovar/annotate_variation.pl -buildver hg38 --geneanno --outfile tmp.anno tmp.annovar ~/biosoft/ANNOVAR/annovar/humandb/

但是注释过后，很诡异的事情发生了！只有一个位点被认为是exon什么的，而且造成的蛋白质改变是G35R，很明显不是我所设计的突变位点，我设计的是G34V，它们这么近，我怀疑还是基因坐标表现形式的问题，而且该位点测序深度高达6000，应该是没有问题 的

line4 nonsynonymous SNV H3F3A:NM_002107:exon2:c.G103A:p.G35R, chr1 226064454 226064454 G A hom 219 6592 60

然后我查看了那些不在exon区域的位点，发现了更奇怪的事情，居然全部在H3F3AP4上面，这个时候我就傻眼了，这个假基因命名定位在

/home/jianmingzeng/reference/gtf/gencode/allGene.hg19.position:chr2 175584636 175585046 H3F3AP4
/home/jianmingzeng/reference/gtf/gencode/allGene.hg38.position:chr2 174719908 174720318 H3F3AP4

怎么也不可能跑到chr1来呀！！！！ANNOVAR到底是如何给我注释的！！！！

我只好去查ANNOVAR的database，发现它居然真的有如此无厘头的记录：

grep H3F3AP4 humandb/hg38_refGene.txt
2309 NR_002315 chr1 + 226062726 226072002 226072002 226072002 4 226062726,226064328,226065655,226071350, 226062811,226064479,226065809,226072002, 0 H3F3AP4 unk unk -1,-1,-1,-1,
1918 NR_002315 chr2 + 174719799 174720841 174720841 174720841 1 174719799, 174720841, 0 H3F3AP4 unk unk -1,

一个基因被记录两个位置，让我好生郁闷！！！而且H3F3AP4很明显是与H3F3A重合了的，我敢打包票，肯定是某人写脚本的时候，没有考虑周全，跟我上一个文章提到的原因一模一样，搞这些数据库维护的单位太多了，总会有不一致的地方。

2309 NM_002107 chr1 + 226062706 226072002 226064351 226071479 4 226062706,226064328,226065655,226071350, 226062811,226064479,226065809,226072002, 0 H3F3A cmpl cmpl -1,0,2,0,

所以，当我们尤其是想确认某一个问题的事情，请务必再三检查！！！