比对工具到现在已经多如牛毛了，见列表： https://en.wikipedia.org/wiki/List_of_sequence_alignment_software 。但是能被大多数人熟知的，就是bowtie和bwa（我们在十一讲中用的才是bwa），它们把测序数据比对到参考基因组之后，都会生成一个sam格式的文件。随后的大部分分析都是基于sam格式进行的分析，虽然Jimmy多次强调这些基础知识的重要性需要大家私下自学。但是由于这个sam文件实在是太重要了！！！所以，不得不亲自抽出一讲来说说它，后面也会基于此写十多篇文章：

因为这个是基础，如果你后面的十几篇有不理解的，请回头来再仔细看看sam文件的定义！

当然，不仅是这些分析是基于对sam文件的理解，我只是举几个例子，大家千万要熟练使用sam格式的比对结果，最权威的定义见：https://samtools.github.io/hts-specs/SAMv1.pdf

记住，我们的双端测序的数据，一个paired reads，有左右两端两条reads，所以在sam文件里面会有且只有两条记录，除非你设置特殊参数，允许输出多比对情况。

上面是一个典型的PEreads输出的sam比对结果，反正必须要有的就是下面11列，其中第3和第7列，可以用来判断某条reads是否比对成功到了基因组的染色体，左右两条reads是否比对到同一条染色体。而第1，10，11列可以提取出来还原成我们的测序数据fastq格式的。第9列是我们建库的时候打断的片段长度，本次是PE150的数据，打断成350bp，所以这里应该是350个字符左右，但如果是RNA-seq数据，就不一样了。

其中第二列flag是比较反人类的，一般人用不了二进制，有网页可以帮助你：http://picard.sourceforge.net/explain-flags.html。我们的sam里面第二列是下面这些二级制转为十进制后的和！

然后第6列CIGAR是比较重要的，解释如下，其中M并不是说match，所以我们的PE 150的reads，大部分都会是150M，但是并不代表着跟参考序列一模一样。其中S/H是比较特殊的，很难讲清楚，但是大部分情况下用不到。（soft-clipping碱基是指一条reads未匹配上当前基因组位置的部分，如果有多个reads在这种情况并且这些reads的soft-clipping碱基都能够比对在基因组另一位置，那么就可能存在SV）

第5列，比对结果的质量值，也是因工具而异。

a. Match score: Score awarded for a base in a sequence matching a base in another sequence

b. Alignment score: Cumulative score of the bases of a sequence matching the bases of another sequence (more this score, better the alignment, if all else equal)

c. Mapping Quality score: Probability that the shorter sequence is mapped to the right spot on the longer sequence.

如果定义某条reads比对的质量值是一个非常复杂的问题，我也没办法说清楚，感兴趣的朋友可以去查看 http://biofinysics.blogspot.com/2014/05/how-does-bowtie2-assign-mapq-scores.html

但是需要记住，质量值越高这个比对越可信，如果质量值为0，可能是该序列在参考基因组有多种定位的可能性。

最后，一般来说，sam文件肯定是大于11列的，后面多余的列是各种各样的 tag。而且只要是你开发了一个比对工具，你就可以定义一堆tag，这个并没有公认的标准，因为sam文件的定义就是前面的11列，后面的tag是随心所欲的！

但是一般RG代表着你的sam文件比对来自于哪个样本的fastq程序结果。NM这个tag是编辑距离，大概就是你的reads如果想转变成参考基因组，需要改变多少个碱基，如果编辑距离是0才说明你的这个150bp长度的序列跟参考基因组一模一样。

MD这个tag里面写明了，你的序列跟参考基因组不同在哪里，比如下面的截图里面的，我的某个位点相比参考基因组来说，就变成了G，而其余的碱基都是一样的。

AS和XS在两个标签貌似没什么用，以后再说吧。

如果你用的bowtie或者hisat等其它比对工具，还会有更多的稀奇古怪的tag，学无止境呀！

请扫描以下二维码关注我们，获取直播系列的所有帖子！