cnvkit被设计来处理同一个批次的多个肿瘤配对样本测序情况，首先对所有的normal数据进行bin处理拿到背景值，然后就这个背景值来处理所有的tumor测序数据计算拷贝数变异情况。
该软件使用比较复杂，建议读一读官网教程。所有的命令都被包装到一个python脚本里面，使用该脚本调用一系列字命令，如下：
- Copy number calling pipeline
每个命令都有自己的特殊功能，需要仔细阅读。
流程图：
流程代码如下：
cnvkit.py access baits.bed --fasta hg19.fa -o access.hg19.bed
cnvkit.py autobin *.bam -t baits.bed -g access.hg19.bed [--annotate refFlat.txt --short-names]
# For each sample...
cnvkit.py coverage Sample.bam baits.target.bed -o Sample.targetcoverage.cnn
cnvkit.py coverage Sample.bam baits.antitarget.bed -o Sample.antitargetcoverage.cnn
# With all normal samples...
cnvkit.py reference *Normal.{,anti}targetcoverage.cnn --fasta hg19.fa [--male-reference] -o my_reference.cnn
# For each tumor sample...
cnvkit.py fix Sample.targetcoverage.cnn Sample.antitargetcoverage.cnn my_reference.cnn -o Sample.cnr
cnvkit.py segment Sample.cnr -o Sample.cns
# Optionally, with --scatter and --diagram
cnvkit.py scatter Sample.cnr -s Sample.cns -o Sample-scatter.pdf
cnvkit.py diagram Sample.cnr -s Sample.cns [--male-reference] -o Sample-diagram.pdf
可以看到软件提供的命令基本上的都用到了，coverage—>fix—>segment—>segment
其实上面这么一大串的命令已经被包装成了一句命令，就是：
cnvkit.py batch *.bam -r my_reference.cnn -p 8
这个一句话命令与上面的多行代码是等效的，默认的segment算法是 circular binary segmentation algorithm (CBS)，也可以用-m切换使用其它算法，比如： faster HaarSeg (haar) or Fused Lasso (flasso)
上面得到的只是segment的结果，还可以call一下：
cnvkit.py call Sample.cns -o Sample.call.cns
cnvkit.py call Sample.cns -y -m threshold -t=-1.1,-0.4,0.3,0.7 -o Sample.call.cns
cnvkit.py call Sample.cns -y -m clonal --purity 0.65 -o Sample.call.cns
cnvkit.py call Sample.cns -y -v Sample.vcf -m clonal --purity 0.7 -o Sample.call.cns
这个时候需要考虑到已有的vcf变异文件，或者计算好的tumor纯度，或者倍性等等。把segment计算得到的log2 ratio值还原成 0,1,2,3,4这样的拷贝数。
但是，事实上上面的代码一般来说是不能直接使用的，因为我们的测序数据通常是WES数据，需要加上很多参数。
实践运行cnvkit
上面流程很复杂，命令也很多，但是不知道也没关系，用起来其实就一个batch命令即可，当然这个batch命令本身参数也不少，而且被设计用来处理不同的数据情况。
# From baits and tumor/normal BAMs
## 同一批次的所有样本N/T测序数据的bam文件一起运行
cnvkit.py batch *Tumor.bam --normal *Normal.bam \
--targets my_baits.bed --annotate refFlat.txt \
--fasta hg19.fasta --access data/access-5kb-mappable.hg19.bed \
--output-reference my_reference.cnn --output-dir results/ \
--diagram --scatter
## 如果新增加了肿瘤测序数据，就运行下面的
# Reusing a reference for additional samples
cnvkit.py batch *Tumor.bam -r Reference.cnn -d results/
# Reusing targets and antitargets to build a new reference, but no analysis
cnvkit.py batch -n *Normal.bam --output-reference new_reference.cnn \
-t my_targets.bed -a my_antitargets.bed --male-reference \
-f hg19.fasta -g data/access-5kb-mappable.hg19.bed
值得注意的就是，如果是全基因组测序数据，用batch --method wgs ，如果是捕获基因组测序，包括全外显子，就用 batch --method amplicon ，然后一定要提供捕获区域的bed文件，一般是外显子加上其侧翼上下游的50bp长度。
人类外显子长度平均是200bp，所以默认的bin是267bp，这样可以把比较长的exon给拆分开来。
还有就是 access 参数需要的文件，
输入输出文件
其中 coverage 命令会对每一个 normal 样本都计算 *.targetcoverage.cnn and *.antitargetcoverage.cnn files , 说明是： target and antitarget coverage tables (.cnn)
这些文件需要合并起来：
cnvkit.py reference *coverage.cnn -f ucsc.hg19.fa -o Reference.cnn
然后再校正区域测序深度及GC含量，之后变成 copy number ratios (.cnr) 文件。
cnvkit.py fix Sample.targetcoverage.cnn Sample.antitargetcoverage.cnn Reference.cnn -o Sample.cnr
最后把 copy number ratios (.cnr) 文件用segment算法跑一下即可，输出cns后缀文件的 segment信息。
对于normal样本只需要输出cnn即可，合并成Reference.cnn，然后把一个个tumor样品，根据这个Reference.cnn来计算 cnr，进而计算 cns 。
最后对于cns可以进行call找到真正的拷贝数。
$ head NPC_merge_marked_fixed.cns |cut -f 1-3,5,8 chromosome start end log2 weight chr1 12098 1701806 -0.183469 84.0794 chr1 1702902 1752401 -0.962192 4.87216 chr1 1752901 12777601 -0.220165 370.756 chr1 12778101 12920301 -1.11688 10.7699 chr1 12920307 27407686 -0.275998 558.214 chr1 27408186 125184087 -0.0447404 2418.53 chr1 143185087 248945922 -0.0422629 2967.61 chr2 10500 5692985 0.151978 85.3751 chr2 5692985 90402011 -0.0329165 1874.56
上面的segment结果还可以call一下，如果有需要的话。
可视化结果：
很明显可以看到有拷贝数变异的区域了。
