空间单细胞DNA测序

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空间单细胞DNA测序技术：Topographic Single Cell Sequencing 发表于2018年CELL杂志，文章题目是：Multiclonal Invasion in Breast Tumors Identified by Topographic Single Cell Sequencing31449-6) 非常值得精读。

背景知识

需要仔细查询以下名词的意思：

  • Ductal Carcinoma in situ (DCIS)
    • Invasive ductal cancer (IDC)
    • DCIS-IDC patients
    • Topographic Single Cell Sequencing (TSCS)
    • the independent lineage model
    • the evolutionary bottleneck model
    • laser-capture microdissection (LCM)
    • whole-genome amplification (WGA)
    • degenerative oligonucleotide PCR (DOP-PCR)
    • single-nucleus sequencing (SNS)
    • Shannon(clonal) diversity
      DCIS-IDC的乳腺癌病人的发病区域有3种细胞： normal stromal cells, in situ ducts, invasive cells，后面就是分析着3种细胞的区别。
      DCIS病人并不一定会发展成为IDC，这一过程机制不明朗，值得探索。难点在于肿瘤异质性，而且stromal太多，肿瘤细胞太少。
      单细胞DNA测序技术很强大，但常规的建库技术都需要细胞悬浮过程，比如 fluorescence-activated cell sorting (FACS),micromanipulation,microdroplets,or nanowells，这样就失去了测序的细胞原来的位置信息，而这个位置信息在研究早期癌症发生进化过程非常重要，所以作者结合了laser-capture microdissection (LCM), laser catapulting, whole-genome amplification (WGA), and single-cell DNA sequencing这4个技术，创造性的开发了Topographic Single Cell Sequencing (TSCS) 技术，并且在10个DCIS-IDC的乳腺癌病人上面应用了，结果表明癌症发生是单一起源，但是在侵袭过程中是多克隆的。

      技术流程

      如下图
      空间单细胞DNA测序技术流程
      一图胜千言，很容易看明白这个流程，就是先对组织样品进行染色，这样可以区分3种细胞，然后利用LCM技术来挑选微小区域的细胞，再利用laser catapulting精准的挑选一个单细胞去建库测序，单细胞的DNA扩增采取的是DOP-PCR技术，最后进行数据分析，找CNV情况，跟原来的空间位置信息进行关联。

      8号病人概况

      如下图
      空间单细胞DNA测序技术流程
      如上图所示，对8号病人，作者从4个病变区域进行采样，总共分析了85 in situ cells and 150 invasive cells，分析测序数据的CNV，使用1-dimensional clustering可以把这些细胞分成4组，其中一组是没有拷贝数变异的二倍体正常细胞。肿瘤细胞分成“A,” “B,” and “C” 这3个亚克隆。使用TimeScape可以分析这些细胞的进化情况。使用multi-dimensional scaling (MDS)分析也得到同样的结果，分成4组，而且可以看到in situ cells 和invasive cells是无法被区分开来的。可以看到3个克隆都起源于ducts，然后A克隆在invasive cells的比例远少于in situ cells ，它的侵袭能力不及B,C克隆。因为B,C克隆部分肿瘤细胞有着EGFR的扩展，这被认为是侵袭能力的象征。

      4号病人概况

      如下图
      空间单细胞DNA测序技术流程
      如上图所示，对4号病人，作者在2额病变区域采用，共分析了46 in situ cells and 58 invasive cells 单细胞DNA测序数据。这个时候分析拷贝数变异得到的是2个肿瘤亚克隆，且都起源于ducts，在侵袭的过程中，B克隆由16% 增长到 67%，但是A克隆由84% 减少到 33%。

      10个病人整合分析拷贝数变异的进化情况

      如下图
      空间单细胞DNA测序技术流程
      对10个病人综合起来总共测了 425 in situ and 503 invasive 和365 stromal diploid cells，这些单细胞DNA测序数据都是可以从SRA数据库里面下载的。可以看到所有病人的亚克隆都不多，在1~5个之间。比较奇怪的是有4个病人都是单克隆，或者说仅仅是从单细胞DNA测序得到的拷贝数变异无法区分不同的克隆。
      即使对于有着多克隆的那些病人来说，并不是所有的克隆在in situ 和 invasive 的比例都发生了变化，说明只有部分克隆是具有高侵袭能力的。

      肿瘤病人的亚克隆和空间信息的对应

      如下图
      空间单细胞DNA测序技术流程
      只有6个病人是有着多克隆的，可以看到所以的克隆都会在 in situ and invasive 区域出现，只是不同的克隆在不同的区域的比例不一样，说明这些克隆起源是单一的，但是侵袭是同步的，取决于各自的侵袭能力。

      3种细胞的外显子测序结果分析

      前面背景介绍过DCIS-IDC的乳腺癌病人的发病区域有3种细胞： normal stromal cells, in situ ducts, invasive cells，作者对这10个病人的3种细胞用 laser-capture microdissection (LCM)技术取1000个左右的细胞进行全外显子测序，并且分析somatic mutation情况。
      如下图
      空间单细胞DNA测序技术流程
      大部分的乳腺癌相关基因，比如TP53, PIK3CA, NCOA2, ABL2, PDE4DIP, AHNAK 都是在ducts和invasive区域都出现了，值得注意的就是 in situ specific (n = 12) or invasive specific (n = 11) in 4 patients (P3, P4, P7, and P8) 这些位点，但是普通的WES技术限制。
      所以作者对12个 in situ-specific 的突变进行了45万X的超高深度测序，发现8个的确是真正的 in situ-specific ，另外4个是WES测序技术限制。但是这8个变异并不像是在侵袭过程中起着关键作用，作者并没有解释这是为什么。但是却说另外4个变异里面的MMP8很重要，因为它在ducts的时候频率很低，到了invasion区域就升高了很多，它应该是那些侵袭相关基因。

      看MAF变化情况

      这里作者重点分析 mutation frequency的变化情况
      如下图
      空间单细胞DNA测序技术流程
      作者就关心那些突变频率发生显著提升的基因，就是 large (>0.5) mutation-frequency changes。的确是发现了7个这样的突变。但是作者并没有解释为什么。
      作者接着利用WES数据的somatic mutation信息和CNV信息，使用 PyClone 2进行亚克隆推断，发现比前面单细胞的CNV信息推断的要多，作者认为是因为ducts区域的点突变多样性先发生了，还没来得及扩散到invasion区域，所以单细胞的CNV是无法区分的。
      还有几个细节我没有仔细介绍，比如TimeScape和 PyClone 2的用法，以及作者提出的多克隆侵袭模型。

      数据公布在SRA

  • https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?study=SRP116771
  • Experiments:1989
    • Runs:1989 (1.1Tbp; 472.2Gb)
      包含着 10 个病人的 norm,ducts,invasive这3个地方的外显子测序数据(~150X)，用来找somatic mutation。
      还有从这10个病人里面取的1293个单细胞的DOP-PCR测序，这些数据只用来找CNV了。
      还有部分基因的超深度测序(~45万X)，看mutation frequency的变化情况，研究超低频突变。
      节选部分如下；
      | Assay_Type | LibraryLayout | LibrarySelection | Library_Name | MBases |
      | ————— | ——————- | ———————— | ———————- | ——— |
      | WGA | SINGLE | RANDOM | P10_SC_INV_065 | 136 |
      | WGA | SINGLE | RANDOM | P10_SC_INV_066 | 124 |
      | WGA | SINGLE | RANDOM | P10_SC_INV_067 | 195 |
      | WGA | SINGLE | RANDOM | P10_SC_INV_068 | 458 |
      | WXS | PAIRED | Hybrid | P10_Norm_Exome | 25677 |
      | WXS | PAIRED | Hybrid | P10_INV_Exome | 12410 |
      | WXS | PAIRED | Hybrid | P10_DCIS_Exome | 45593 |
      | WGA | SINGLE | RANDOM | P10_SC_DCIS_076 | 358 |
      | WGA | SINGLE | RANDOM | P10_SC_DCIS_077 | 272 |
      | WGA | SINGLE | RANDOM | P10_SC_DCIS_078 | 341 |
      | WGA | SINGLE | RANDOM | P10_SC_DCIS_079 | 340 |
      | WGA | SINGLE | RANDOM | P10_SC_DCIS_080 | 323 |

323

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