你现在看到的是文献俱乐部2019年笔记分享第一弹，我将会在春节7天连续分享，目录如下：

2019年2月份第1周（总第53周）胃癌类器官

2019年2月份第2周（总第54周）测173个成年人的大脑的102个基因

2019年2月份第3周（总第55周）2.5万汉族人的GWAS乳腺癌风险基因

因为学业需要，我阅读的大量文献都是NGS组学相关，所以会涉及到很多数据处理，而这些文献基于的生物信息学数据处理技巧，我都在过去的5年里以各种形式分享讲解过，也有系列视频，希望你可以在方便的时候再次学习一遍，查漏补缺。也欢迎推荐给有需要的朋友

学习笔记目录
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2.生信人应该这样学R语言系列视频学习心得笔记分享
3.一万人陪你学习GEO数据库挖掘知识（公益视频听课笔4.记分享）
5.公共数据库挖掘视频学习心得体会
6.生信小技巧系列第一季完结版视频教程学习笔记分享
……期待有你……

如果，你不仅仅是对NGS组学应用文献感兴趣，也欢迎加入我们文献阅读小组分享自己的主页领域文献。
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测54个成年人的173个大脑区域的102个基因

文章发表在NC，于2018年10月中旬，题目是：High prevalence of focal and multi-focal somatic genetic variants in the human brain ，测序数据都上传到了：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra?term=SRP159015 是开放下载的。
研究者相信干细胞分裂过程中产生的 somatic 突变，是很多癌症的罪魁祸首。理论上大脑发育过程中的那些细胞分裂，也会伴随着同样的突变过程，所以呢，就会在局部富集一些 somatic 突变。然后作者假设那些somatic突变位点如果发生在已知的明确基因上，而且位点一致，具有germline病理性性突变效果。
根据超高深度测序，研究团队发现并且证实了54个成年人的173个大脑区域的102个基因的确有一些 somatic 突变，包括 DNMT3A 和TET2 这样可能起源于血液的突变。使用神经发育学的数学模型和近似贝叶斯推断理论，研究者预测，大片段的病理性的突变神经元是非常普遍的在人群中。

背景介绍

神经退行性疾病，比如Parkinson’s disease (PD) and Alzheimer’s disease (AD)都是大脑区域细胞病理化，大部分这样的病例都是散发的，但是有约~5%的病例是有明确遗传倾向的，目前GWAS研究只得到了约莫 50 个人易感基因。
名词解释：

accuracy and content enhanced (ACE) platform of 5374-fold , 针对捕获基因
HaloplexHS, sequenced to a mean depth of 6830-fold, s.d. = 1549) 针对找到的位点
SRMs： single region mutations ，Somatic mutations that were present in only one brain region
MRMs：multi-region mutations，Somatic mutations that were present in more than one sample
variant allele frequency (VAF), 突变碱基比例
具有somatic突变的细胞小群体。
突变碱基比例低于5%，在常规肿瘤WES里面是会被somatic caller的默认阈值直接过滤的。

测序实验概览

总体来说，是两个ngs平台，54个受试者，173个脑部区域，最后找到了62个突变，如下：

超深度测序的173 frozen brain regions 样本病人来源：
post-mortem cases of AD (n = 20 brains)
Lewy body (LB) disease (PD or Dementia with LB: n = 20 brains)
age matched controls with no significant neuropathology (n = 14 brains)
有配对的血液样品的病人是6个：(control: n = 2, AD: n = 1, LB: n = 3)
涉及到的大脑区域包括：
cerebellum: CB = 54,
Entorhinal cortex: EC = 53,
Frontal cortex:FC = 32,
Medulla:Med = 24,
Cingulate: Cin = 10
大脑区域示意图如下：

只对102个基因的编码区域进行捕获测序，平均测序深度高达5374X。

39个位点的62个突变

其中62个突变分成：
56 single-nucleotide variants, SNVs;
6 insertion-deletion variants, indels
其中18个突变只出现在单个受试者的单个大脑区域，这里定义为 SRMs，它们的VAF平均只有 0.84% (s.d. = 0.005)，这个突变频率低的有点夸张了，要不是这样的超高深度测序平台，根本就很难检测到它们。然后它们也并没有很明显的大脑区域分布偏好性，也没有很明显的基因分类偏好特异性。但是14个 C > T 形式突变，只有4个是其它形式突变。

数据分析流程的测试

这里，研究团队选取了最常见的两款somatic突变搜寻工具，就是mutect2和varscan，最后由于作者针对的少量基因组区域的超高深度测序，所以可以使用DeepSNV方法。
这里研究者使用千人基因组计划的两个不同个体的DNA的不同比例混合样品来模拟不同比例的肿瘤含量样品，这样找somatic突变就有了正确与否的判断标准。
这样就可以测试不同测序深度下，这些工具的准确率，召回率等机器学习指标表现情况。

上面的D图说明超过4000X的测序深度的必要性。
VAF > 1% were consistently detected when the sequencing depth was >1000-fold
but VAF >0.5% required >4000-fold depth to minimise the false-negative rate of any caller across the 102 gene 285 kb panel
根据上面的C图，最后作者定下来的数据分析策略是:

两个平台的一致性

两个平台是：
accuracy and content enhanced (ACE) platform of 5374-fold , 针对捕获基因
HaloplexHS, sequenced to a mean depth of 6830-fold, s.d. = 1549) 针对找到的位点
针对同一个位点，绘制突变碱基频率的散点图可以看两个平台的相关性，如下，可以说是非常棒的相关性！

还有测序深度和覆盖度的区别：

展示那些首先被SureSelect ACE 平台检测到的somatic突变，然后也被Haloplex HS平台验证的，同样也是说明两个平台的一致性，同时也说明这些突变的真实可靠。

Haloplex HS 平台的特殊性

两个基本假设：
新发突变随机分布在后代细胞
神经发育过程中细胞是对称分裂
Haloplex HS 平台是基于 barcode tagging 方法，所以可以计算每次测序的细胞总数，以及含有somatic突变的细胞数量。
因为测序的细胞总量是 ~611,000 cells, 所以根据具体的某个somatic突变的VAF可以近似推断含有该突变位点的细胞数量。

突变特征分析

因为找到的somatic突变比较少，还区分了SRMs和MRMs，我个人觉得，绘制下图几乎看不出啥规律，只能说是SRMs的C->T突变比例高于MRMs。

根据测序结果建模，一般人含有这样的低频somatic突变的个数的比例。

主要结论

有17个突变出现在同一个人的不同脑部区域。
有9个人的大脑不止一个somatic突变。
尽管在脑部细胞发育早期影响约1000个细胞左右的那些病理突变非常稀有，仍然是有可能造成疾病表型，因为他们有可能影响大量的神经元。作者的研究虽然样本量不多，但是提出另一种新的解释，那些影响了世界10%人口的散发性神经退行性疾病机理，提早检测出那些突变，在医疗上很重要。