乳腺癌浸润T细胞的单细胞RNA测序 -（2019年8月份）第32周（总第80周 ）

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发表在 Nature Medicine (2018) ，标题是：Single-cell profiling of breast cancer T cells reveals a tissue-resident memory subset associated with improved prognosis 作者从3个乳腺癌患者体内通过FACS筛选到乳腺癌中肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），使用商业仪器10X来做单细胞转录组，得到6,311个T细胞数据。

肿瘤免疫浸润T细胞

T淋巴细胞来源于骨髓的多能干细胞，相当复杂的不均一体、又不断在体内更新、在同一时间可以存在不同发育阶段或功能的 亚群，但分类原则和命名比较混乱，尚未统一。按免疫应答中的功能不同，可将T细胞分成若干亚群，一致公认的有：

  • 1、辅助性T细胞（Helper T cells,Th），具有协助体液免疫和细胞免疫的功能，Th细胞又被称为CD4+细胞，因为其在表面表达CD4(cluster of differentiation 4）
  • 2、抑制性T细胞（Suppressor T cells,Ts），具有抑制细胞免疫及体液免疫的功能；
  • 3、效应T细胞（Effector T cells,Te），具有释放淋巴因子的功能；
  • 4、细胞毒性T细胞（Cytotoxic T cells,Tc），具有杀伤靶细胞的功能；Tc细胞又名为CD8+细胞，其表面表达CD8.这类细胞可以通过MHCI 与抗原直接结合，也被称为杀手T细胞。
  • 5、迟发性变态反应T细胞（Delayed type hypersensitivityT cells,Td），有参与Ⅳ型变态反应的作用；放大T细胞（Ta），可作用于Th和Ts，有扩大免疫效果的作用；
  • 6、原始的或天然T细胞（Virgin or Natural T cells），他们和抗原接触后分化成效应T细胞和记忆T细胞；
  • 7、记忆T细胞（Memory T cell,Tm），有记忆特异性抗原刺激的作用。T细胞在体内存活的时间可数月至数年。其记忆细胞存活的时间则更长。
    肿瘤免疫浸润T细胞，（tumor infiltrating lymphocyte,TIL），TIL细胞表型具有异质性。一般来说，TIL中绝大多数细胞CD3阳性。不同肿瘤来源的TIL细胞中，CD4+T细胞、CD8+T细胞的比例有差异。大多数情况下以CD8+T细胞为主。TILs的数量是提高患者存活率的关键预后因素，尤其是在三阴性和HER2过表达的乳腺癌亚型中。虽然T细胞是主要的TIL群体，但T细胞亚群定量和定性差异和患者预后之间的关系仍然未知。

    单细胞转录组数据产生

    研究者从人乳腺癌中分离出的6,311个T细胞进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq），使用商业仪器10X来做单细胞转录组。
    image-20190820154431459

    单细胞转录组分析

    使用 R包 Seurat 得到 unique molecular identifier (UMI) count matrix 经过一系列过滤，最后剩下 5,759 single cells and 15,623 genes 进行后续分析。 单细胞相关数据在： GSE110686, SRX3710117 and SRX3710118.
    bulk转录组测序表达矩阵在 GSE110938. 是完全公开的，但是其fastq文件在 EGAS00001002845需要申请才能获得下载权限。

    近6千细胞分成10群

    分群的tSNE图如下：
    image-20190820154715303
    总体上来说，肿瘤浸润淋巴细胞可以区分为CD4,和CD8阳性，TIL中绝大多数细胞CD3阳性。不同肿瘤来源的TIL细胞中，CD4+T细胞、CD8+T细胞的比例有差异。大多数情况下以CD8+T细胞为主
    可以热图可视化这些不同亚群细胞的TOP10差异基因：
    image-20190820154750554
    当然，还有Feature plots，小提琴图各种形式，来查看感兴趣基因在不同亚群细胞的表达量分布情况。

    差异分析

    首先是 CD8+ TRM like (n = 685 cells across both cases) and TEM-like clusters (n = 953 cells across both cases) 这里作者直接使用DECENT进行单细胞转录组的差异分析，结果以火山图形式展现：
    image-20190820154622030
    值得注意的是，作者重点关注 组织驻留记忆T细胞（tissue-resident memory T ，TRM） , 也就是说把TRM和所有其它单细胞转录组细胞进行比较，才得到 TRM signature (genes that were significantly upregulated in the TRM cluster as compared with the other clusters FDR < 1% and log foldchange > 1.0)

    拟时序分析

    正文展现的是n = 2,005 cells in CD8+ clusters 的拟时序分析，使用monocle2包：
    image-20190820155138884

    细胞周期推断

    这里仍然是使用 ： The Cyclone model assigns cell cycle phases to individual cells based on expression profile.
    image-20190820154250961

    单细胞转录组和bulk的比较

    这里作者对bulk转录组数据做了标准差异分析，然后跟单细胞转录组的同样的差异分析结果进行比较。
    bulk转录组测序表达矩阵在 GSE110938. 3 VS 3的比较，很容易做差异分析。
    | ID | description |
    | —————————————————————————————— | ——————————————— |
    | GSM3019132 | Primary breast cancer 1 CD103+ |
    | GSM3019133 | Primary breast cancer 1 CD103- |
    | GSM3019134 | Primary breast cancer 2 CD103+ |
    | GSM3019135 | Primary breast cancer 2 CD103- |
    | GSM3019136 | Liver metastasis CD103+ |
    | GSM3019137 | Liver metastasis CD103- |
    火山图如下：
    image-20190820162438365
    不得不说，图画的真的很漂亮。

    生存分析检验不同亚群的基因集的临床意义

    这里主要是组织驻留记忆T细胞（tissue-resident memory T ，TRM） ，从a.b图可以看到TRM基因集区分生存非常显著，但是 c.d图可以看到，CD8A单独是无法区分生存的。
    image-20190820160815901
    在METABRIC数据集看TRM基因集信号差异，其中TRM基因集来自于单细胞转录组数据，在不同亚群乳腺癌病人的信号值的计算需要仔细读文献去找找。
    image-20190820161012300
    还可以看到checkpoint blockade in patients with melanoma 免疫疗法反应与否的病人之间 ，responders (n = 9) compared with nonresponders (n = 36) 的 TRM基因集的确是显著富集，这个数据集来自于：https://github.com/riazn/bms038_analysis/ 感兴趣的同学可以去了解一下，复现这个图表。
    image-20190820161051429
    不知道你看到这里，找到TRM基因集里面具体的基因了吗？ 这个基因集，就很有可能在你将来的研究里面使用起来哦。

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