单细胞转录组数据预处理之过滤不合格细胞和基因

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现在一起看看拿到表达矩阵后有一个很重要的质控过程，就是根据一些阈值来过滤不合格细胞和基因。细胞的不合格很容易理解， 可能是那个细胞检测到的基因数量太少，或者太多，也许是那个细胞的文库大小异常，都是需要谨慎考虑是否管理它。
基因的不合格，就需要大家对人类参考基因组的注释信息有所背景了。走RNA-seq定量流程，拿到的表达矩阵通常是取决于gtf文件的注释程度，人类的gtf里面五万多个基因，不可能都在你的单细胞转录组项目数据里面出现。

首先细胞的取舍主要是看文库大小和检测到的基因数量

单细胞转录组通常使用10x数据，所以细胞数量惊人，每个样本可以是3000到10000的细胞数量都可以，取决于实验设计。每个细胞平均可以是1到10万的reads文库，都没有问题。
那么，每个细胞可以检测到多少基因数量呢，就取决于每个细胞分到的reads总数，1到10万的reads文库对应着200到1000的基因数量。
但是Smart-seq2技术的单细胞数据就不一样了，每个样本细胞数量通常是96的倍数，500个左右就很厉害了，然后每个细胞的reads就可以很多，百万级别都没有问题。所以检测到基因数量也很多，如下：
image-20200205203520802
所以在你设置阈值来过滤不合格细胞的时候，一定要先理解好你的单细胞转录组数据，给全部的细胞检测到的基因数量绘制一个boxplot，看看哪些细胞所检测到的基因数量偏多或者偏少，一般来说，这样的的离群细胞就是你需要去除的！比如我在单细胞转录组教学就介绍过一个代码：

box <- lapply(colnames(sample_ann[,1:19]),function(i) {
 dat <- sample_ann[,i,drop=F] 
 dat$sample=rownames(dat)
 ## 画boxplot 
 ggplot(dat, aes('all cells', get(i))) +
 geom_boxplot() +
 xlab(NULL)+ylab(i)
})
plot_grid(plotlist=box, ncol=5 )

这样的话细胞的上游指标可以批量检验，如下：
image-20200219233159608
可以看到，每个细胞的测序文库大小和检测到基因数量虽然很重要，上游分析的其它质量指标，比对率，质量分数，duplicate情况，插入片段，内含子误差其实也会影响这个细胞的取舍。

然后是删除一些基因

前面我们提到过，gtf文件的注释程度不一样，拿到的表达矩阵通常是全部的基因，比如人类的gtf里面五万多个基因，你的表达矩阵就是5万多行。
实际上，大量的基因在你所有的细胞里面都是不表达的，这就是表达量全部为0的，肯定是需要去除啦。
还有一些基因仅仅是在5%左右的细胞表达，这个时候就很主观了，可能确实这个基因是那5%的稀有细胞的marker基因，也有可能就是单细胞转录组技术导致这个基因大量的drop-out了。
这个时候，你就需要卡一个阈值，到底一个基因表达多少算是表达呢，到底一个基因在多少个细胞里面有表达，你才保留下去，做下游分析呢？

后记

当然了，过滤细胞或者基因仅仅是单细胞转录组项目质量控制的开始，后面还有线粒体基因含量，核糖体基因含量，高表达量基因比例，细胞周期，批次效应，我们慢慢聊哈。

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