最近接到粉丝求助，他最近在跟着我B站课程和GitHub代码处理GEO 芯片：

GSE113486 GEO平台 已经进行了log2 转换和 Normalized signal intensity by internal control miRNAs. 我画了他们的箱式图是这样的。不太整齐。我不确定是不是还要进行normalizeBetweenArrays处理。我看你的视频课程是说要样本间要整齐，但是课题组师兄师姐说他们没看这个，直接做差异分析的，所以比较困惑后续处理的细节把握。

箱线图如下：

可以看到，肿瘤样品的表达量整体就比正常对照样品的表达量高出一大截，这样的数据进行后续分析，就会出现大量的上调基因。
因为我一直强调，做表达矩阵分析一定要有三张图，见：你确定你的差异基因找对了吗？ ，所以就让粉丝继续摸索，其中PCA如下：

可以看到，两个分组是泾渭分明的，这可能是生物学差异，因为肿瘤样品就肯定跟正常组织不一样的啊，也有可能是批次效应。所以我给粉丝的建议是两个策略

• 第一个策略是直接normalizeBetweenArrays处理，然后走差异分析。
• 第二是先去除批次效应，然后走差异分析。
  建议你比较一下，这两个差异分析的区别。
  然后粉丝的行动也很迅速，两三天就回复了邮件，给出了两个摸索结果：
  
  可以看到，直接normalizeBetweenArrays处理其实就是一个quantile的normalization而已，大家可以去看quantile normalization到底对数据做了什么 - 简书，了解一下。
  从韦恩图可以看到，没有进行normalizeBetweenArrays处理之前呢，上调基因真的是超级多啊！经过了normalizeBetweenArrays处理之后呢，其中616个上调基因变成了没有显著性改变的基因，然后637个居然由上调基因变成了下调基因，当然了，也有341个基因维持原来的上调属性。
  是不是很可怕！！！
  
  粉丝下的这个结论很正确，这个时候使用 limma 的 removeBatchEffect 函数来矫正批次效应，肯定是错的，因为完全没有搞清楚矫正批次效应的统计学原理。
  其实几年前我在《单细胞天地》公众号发起过一个谈论，见：到底是批次效应还是真实生物学差异，如果你仅仅是做了两个单细胞转录组样品，想合并这两个数据再后续分析，就面临着两个样品（处理前后的生物学差异）本身的批次效应（不同时间点取样，不同10x上机时间等等）。因为是单细胞，一个样品里面本身就有这成千上万个细胞，可以针对两个样品内部的某些具有不变属性的单细胞来作为锚定，从而比较好的合并两个样品的单细胞转录组数据。
  但是，如果是bulk转录组测序，或者表达量芯片，就基本上不可能做到区分具有生物学差异的两个样品的批次效应了。虽然说我在《生信技能树》写过不少相关教程，比如：多种批次效应去除的方法比较，但那样的去除是针对生物学差异与批次效应交叉的情况来去除。比如：
• 第一个批次：2个处理，2个对照样品
• 第二个批次：3个处理，3个对照样品
  这个时候，就可以使用 limma 的 removeBatchEffect 函数或者 sva 的 ComBat 函数，把批次效应去除掉，然后保留生物学差异供后续的差异分析。
  但是如果你的实验设计是：
• 第一个批次：3个处理样品
• 第二个批次：3个对照样品
  那我就只能奉劝你，对这个数据集说拜拜了！

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