我注意到绝大部分肿瘤相关的单细胞转录组研究的落脚点都是在肿瘤免疫微环境个细胞亚群比例，包括 B细胞，T细胞，巨噬细胞，树突细胞等等，而且这些细胞亚群都是可以继续细分。但实际上在没有单细胞转录组数据这个技术之前，也是可以探测肿瘤免疫微环境个细胞亚群比例的，比如流式细胞仪。但是我查了一下，发现这个仪器还蛮贵的，比如一个招标信息《上海交通大学流式细胞分选仪，200万》：

既然流式细胞仪如此昂贵，那我们就一起看看流式细胞仪是如何探测肿瘤免疫微环境个细胞亚群比例的吧。以发表在Front. Immunol., 01 February 2019 | https://doi.org/10.3389/fimmu.2018.03101的文章为例子，标题是：《Immune Cell Composition in Human Non-small Cell Lung Cancer》，该研究探索了 免疫组成情况 in adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, distal lung, regional lymph node, and PBMCs in the cohort of NSCLC patients (n = 68).
这些病人根据吸烟情况分成3组：

• (i) active/present smokers (n = 32),
• (ii) former smokers (n = 28)
• (iii) those who had never smoked(n = 8; )
  不过数据分析主要是lowJo V10 software (FlowJo, LLC)，并没有涉及到R语言，而且也没有上传FCS文件。

  免疫细胞亚群的分布情况

  首先CD3+ T cells在肺腺癌和肺鳞癌都是占比接近50%，其细分为CD4+ T cells和CD8+ T cells，其它细胞亚群比例详细如下表：
  
  看不同分组的各个免疫细胞亚群比例情况：
  

  BD公司的Flow Cytometry技术的panel

  该研究使用了BD LSRFortessa flow cytometer (BD Bioscience).公司的Flow Cytometry技术，设计了6个panel，在(Supplementary Tables 1–6). 详细列出来了各个panel的抗体组成。
  

  假如提供了FCS文件

  就可以follow我们的教程，完成cytof数据处理的主要步骤，读入文件，质量控制，降维聚类分群，生物学注释和细胞亚群比例差异分析啦，目录如下：

• 1.cytof数据资源介绍（文末有交流群）
• 2.cytofWorkflow之读入FCS文件（一）
• 3.cytofWorkflow之构建SingleCellExperiment对象（二）
• 4.cytofWorkflow之基本质量控制（三）
• 5.cytofWorkflow之聚类分群（四）
• 6.cytofWorkflow之人工注释生物学亚群（五）
• 7.cytofWorkflow之亚群比例差异分析（六）
  

  学徒作业：同类型文献查询

  既然这个流式细胞仪可以应用到非小细胞肺癌来探测肿瘤免疫微环境个细胞亚群比例，很容易想到这个课题思路切换到其它癌症领域，所以大家变换关键词查询一下TCGA列表的其它癌症是否有类似的文献。然后阅读一下寻找那些同时公布了FCS文件的，这样方便我们进行一定程度的图表复现。