徒有虚名的单细胞转录组

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最近交流群有小伙伴提问《单细胞转录组》数据分析，我给了他我录制好了3个系列视频，和十套完整代码。但是对方说根本就没有用，我就纳闷了， 我的资料教会了那么多人单细胞数据分析，为什么就渡不了他呢？
就问了他数据集，结果是来源于一个2021发表的最新文献，广西大学的，标题是：《Single-Cell RNA-Seq Revealed the Gene Expression Pattern during the In Vitro Maturation of Donkey Oocytes》，我直接进入文章正文搜索其公布的单细胞数据情况，很容易可以看到：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra?linkname=bioproject_sra_all&from_uid=763991
全部的六个样品如下所示：

ILLUMINA (Illumina NovaSeq 6000) run: 23.1M spots, 6.9G bases, 2Gb downloads
Accession: SRX12217372
ILLUMINA (Illumina NovaSeq 6000) run: 20.1M spots, 6G bases, 1.8Gb downloads
Accession: SRX12217371
ILLUMINA (Illumina NovaSeq 6000) run: 21.8M spots, 6.5G bases, 1.9Gb downloads
Accession: SRX12217370
ILLUMINA (Illumina NovaSeq 6000) run: 23.2M spots, 6.9G bases, 2.1Gb downloads
Accession: SRX12217369
ILLUMINA (Illumina NovaSeq 6000) run: 24M spots, 7.1G bases, 2.2Gb downloads
Accession: SRX12217368
ILLUMINA (Illumina NovaSeq 6000) run: 19.7M spots, 5.8G bases, 1.9Gb downloads
Accession: SRX12217367

也就是说，它并不是我们常规描述的单细胞转录组数据，其实本质上仍然是一个普普通通的转录组数据，分成了2个组，每个组里面是3个样品而已！
既然是常规的转录组实验设计，所以基本上按照我们转录组数据分析思路来即可！

首先是质量控制

质量控制最重要的就是3张图了啊，如下所示：
是质量控制
我在生信技能树的教程：《你确定你的差异基因找对了吗？》提到过，必须要对你的转录水平的全局表达矩阵做好质量控制，最好是看到标准3张图：主成分图和样品相关性热图，都是为了说明我们的分组的差异是大于组内样品的差异的。

然后是差异分析

既然说明了们的分组的差异是大于组内样品的差异的，接下来就可以很简单的对两个分组进行普普通通的差异分析啦！
差异分析的图表也是固定的，火山图和热图！这个基本上 公众号推文即可，在：

  • 解读GEO数据存放规律及下载，一文就够
  • 解读SRA数据库规律一文就够
  • 从GEO数据库下载得到表达矩阵 一文就够
  • GSEA分析一文就够（单机版+R语言版）
  • 根据分组信息做差异分析- 这个一文不够的
  • 差异分析得到的结果注释一文就够
    火山图和热图

    最后是上下调基因的go和kegg数据库注释

    有了上下调基因列表，就可以进行标准的生物学功能数据库注释了，其实MSigDB（Molecular Signatures Database）数据库中定义了已知的基因集合：http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb 包括H和C1-C7八个系列（Collection），每个系列分别是：

  • H: hallmark gene sets （癌症）特征基因集合，共50组，最常用；
  • C1: positional gene sets 位置基因集合，根据染色体位置，共326个，用的很少；
  • C2: curated gene sets：（专家）校验基因集合，基于通路、文献等：
  • C3: motif gene sets：模式基因集合，主要包括microRNA和转录因子靶基因两部分
  • C4: computational gene sets：计算基因集合，通过挖掘癌症相关芯片数据定义的基因集合；
  • C5: GO gene sets：Gene Ontology 基因本体论，包括BP（生物学过程biological process，细胞原件cellular component和分子功能molecular function三部分）
  • C6: oncogenic signatures：癌症特征基因集合，大部分来源于NCBI GEO 发表芯片数据
  • C7: immunologic signatures: 免疫相关基因集合。
    不过，通常情况下，大家并不需要对MSigDB数据库的全部类别的全部基因集进行注释，看看go和kegg数据库注释即可，如下所示：
    go和kegg数据库注释

    全文升华需要一个故事落脚点

    作者选择了 glycosylation genes. 主要是 N-Glycan biosynthesis 和 mucin-type O-Glycan biosynthesis 这两个 通路进行热图可视化。
    而且，按照惯例，大家会实验验证部分差异基因，因为历史遗留原因，大家对ngs的高通量找差异的结果持怀疑态度。一般来说，就是 qPCR Validation 啦！

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