两种筛选和分析特定的细胞亚群的技术你pick谁（GFP报告系统和抗体标记）

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交流群里面小伙伴发了一个小鼠的肝脏单细胞转录组数据文章，说不会读取作者给出来的矩阵，文章是2019的：《Single-Cell Transcriptomics Uncovers Zonation of Function in the Mesenchyme during Liver Fibrosis》

数据集是：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE137720，作者给出来的是如下所示的文件：

GSM4085623_10x_1_barcodes.tsv.gz 27.0 Kb
GSM4085623_10x_1_genes.tsv.gz 212.7 Kb
GSM4085623_10x_1_matrix.mtx.gz 50.1 Mb
GSM4085624_10x_2_barcodes.tsv.gz 28.8 Kb
GSM4085624_10x_2_genes.tsv.gz 212.7 Kb
GSM4085624_10x_2_matrix.mtx.gz 68.1 Mb

所以是只需要很简单的改名即可，如下所示：

├── [ 160] GSM4085623_10x_1
│   ├── [ 27K] barcodes.tsv.gz
│   ├── [213K] features.tsv.gz
│   └── [ 50M] matrix.mtx.gz
├── [ 160] GSM4085624_10x_2
│   ├── [ 29K] barcodes.tsv.gz
│   ├── [213K] features.tsv.gz
│   └── [ 68M] matrix.mtx.gz
├── [ 160] GSM4085625_10x_3
│   ├── [ 22K] barcodes.tsv.gz
│   ├── [213K] features.tsv.gz
│   └── [ 45M] matrix.mtx.gz
├── [ 160] GSM4085626_10x_4
│   ├── [ 23K] barcodes.tsv.gz
│   ├── [213K] features.tsv.gz
│   └── [ 31M] matrix.mtx.gz
└── [ 160] GSM4085627_10x_5
 ├── [ 23K] barcodes.tsv.gz
 ├── [213K] features.tsv.gz
 └── [ 34M] matrix.mtx.gz

每个样品都是标准的3个文件，在同一个文件夹里面，就可以批量读取啦：


dir='GSE137720_RAW/outputs/' 
samples=list.files( dir )
samples

# samples = head(samples,10) 
sceList = lapply(samples,function(pro){ 
 # pro=samples[1] 
 print(pro) 
 sce =CreateSeuratObject(counts = Read10X(file.path(dir,pro )) ,
 project = gsub('^GSM[0-9]*_','',
 gsub('filtered_feature_bc_matrix','',pro) ) ,# pro, #
 min.cells = 5,
 min.features = 500 )
 return(sce)
})
names(sceList)

# gsub('^GSM[0-9]*','',samples)
sce.all=merge(x=sceList[[1]],
 y=sceList[ -1 ],
 add.cell.ids = gsub('^GSM[0-9]*_','',
 gsub('filtered_feature_bc_matrix','',samples)) )
# gsub('_gene_cell_exprs_table.txt.gz','',
# gsub('^GSM[0-9]*_','',samples) )

as.data.frame(sce.all@assays$RNA@counts[1:10, 1:2])
head(sce.all@meta.data, 10)
table(sce.all$orig.ident)

后面的降维聚类分群就是常规的代码即可，我顺便看了看文章的降维聚类分群结果，蛮有意思的：

文章的降维聚类分群结果

也就是说，里面并没有我们通常看到了免疫细胞，上皮细胞等等，仅仅是mesenchymal类型的单细胞。Mesenchymal细胞、免疫细胞和上皮细胞是三种不同类型的细胞，它们在结构、功能和位置等方面存在显著差异。

  1. Mesenchymal细胞：
    • 起源：Mesenchymal细胞源自胚胎中的中胚层组织。它们可以分化为多种不同类型的细胞，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。
    • 结构：Mesenchymal细胞通常呈纤维状或星形，具有多分支突起。
    • 功能：它们在修复组织和骨骼发育中起着重要作用。Mesenchymal干细胞也有抑制免疫反应和抗炎作用的能力。
    • 位置：Mesenchymal细胞分布广泛，可以在骨髓、脂肪组织、肌肉和其他结缔组织中找到。
  2. 免疫细胞：
    • 起源：免疫细胞是免疫系统的一部分，包括各种类型的白血细胞，如T细胞、B细胞、巨噬细胞、粒细胞等。
    • 结构：免疫细胞具有多样性的形态和结构，根据类型不同而异。
    • 功能：它们的主要功能是保卫机体免受感染和疾病。免疫细胞可以识别和清除病原体、感染细胞和异常细胞。
    • 位置：免疫细胞分布于全身的淋巴组织、血液和组织中，以便对抗感染。
  3. 上皮细胞：
    • 起源：上皮细胞源自外胚层组织，构成身体的皮肤、黏膜、内脏器官等外界和内界表面的组织。
    • 结构：上皮细胞通常密集排列，具有紧密连接的细胞间连接，形成生物屏障。
    • 功能：它们的主要功能是构成生物屏障，保护内部组织免受外界环境的侵害，同时也参与分泌和吸收等生理过程。
    • 位置：上皮细胞分布于皮肤、呼吸道、消化道、泌尿道、生殖道等器官的黏膜表面，也构成内脏器官的外层。

总结来说，这三种细胞类型在起源、结构、功能和位置等方面都存在差异。Mesenchymal细胞具有多向分化潜能，免疫细胞主要用于免疫防御，而上皮细胞构成生物屏障。它们各自在人体中担任不同的生物学角色。

我们自己读取它之后的降维聚类分群，也是如此：

自己读取它之后的降维聚类分群

没有文章那么干净的3个分群

其实GFP报告系统我的第一次看到

而之所以上面的数据集都是仅仅是mesenchymal类型的单细胞，是因为前面的实验设计方面做了：isolate the different GFP+ mesenchymal cell populations

因为是a Pdgfrb-GFP knockin reporter mouse to label all mesenchymal cells in the mouse liver ，而且 Pdgfrb-GFP mouse labeled PDGFRb+ cells in liver with high efficiency and specificity

这个GFP报告系统：

  1. 原理：GFP报告系统利用基因工程技术将GFP基因插入到感兴趣的基因或表达的蛋白质上。当目标基因表达时，GFP也被表达，使得这些细胞或蛋白质发出绿色荧光，可以轻松识别和分离。
  2. 应用：GFP报告系统常用于追踪基因表达、蛋白质定位、基因调控研究等。它通常用于细胞培养和显微镜下观察。
  3. 优点：
    • 高灵敏度：GFP荧光强度可以直接与目标基因或蛋白质的表达水平相关联。
    • 不需要杀死细胞：细胞可以保持活性，适用于动态研究。
    • 显微镜下观察：可以直观观察单个细胞或亚细胞结构。
  4. 缺点：
    • 通常需要基因工程：要利用GFP报告系统，需要对目标细胞进行基因工程改造，这可能会影响其生理特性。
    • 不适用于活体体内研究。

但是使用各种抗体的流式细胞筛选就很常见了

实际上，这个 fluorescence activated cell sorting (FACS)技术，就可以根据上面的荧光标记物（如GFP）进行细胞分选：

  1. 原理：流式细胞仪使用激光或其他光源来激发细胞或微粒中的荧光标记物（如GFP）。随后，探测器检测和记录细胞荧光的强度和波长，从而对细胞进行鉴定、计数和分析。
  2. 应用：流式细胞仪广泛用于细胞生物学研究、细胞表型分析、细胞周期分析、免疫分析等。它适用于各种样本类型，包括细胞培养、血液、组织等。
  3. 优点：
    • 高通量：流式细胞仪可以快速分析大量细胞，允许高通量筛选。
    • 多参数分析：可以同时分析多种荧光标记，提供多维数据。
    • 适用于多种样本：可以用于不同来源的样本，包括体内和体外。
  4. 缺点：
    • 需要样本制备：样本需要进行特殊的处理和标记以适应流式细胞仪的分析。
    • 有限的分辨率：流式细胞仪不能提供像显微镜一样高分辨率的图像。
    • 昂贵：流式细胞仪的购买和维护成本较高。

比如2022的文章：《Single-cell RNA sequencing reveals time- and sex-specific responses of mouse spinal cord microglia to peripheral nerve injury and links ApoE to chronic pain》，就是使用FACS 技术，进行 gating for CD45lowCD11BhighCX3CR1high cells.

FACS 技术

可以看到，拿到的单细胞转录组数据里面的基本上都是小胶质细胞，非常干净：

基本上都是小胶质细胞

小胶质细胞（Microglia）是胶质细胞中体型最小的一种， 也俗称大脑的巨噬细胞。

胞体细长或椭圆，小胶质细胞的形态变化多样，大致有分枝型、阿米巴型、肥大型，杆型，营养不良（衰老）型，卫星型等6种形态。小胶质细胞的形态和功能变化多样，因此找到小胶质细胞不同状态下的标志物是共同需求，目前关于小胶质细胞标志物的分类从来源上说分为刺激信号、细胞相关蛋白以及分泌因子三类，从小胶质细胞活化类型大致分为稳态型、M1型以及M2型（可细分为M2a、M2b、M2c）四种，随着研究的深入，分类的精细程度会逐渐增高。

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