院士团队的WGCNA挖掘文章修改成为癌症转移与否关键模块

基本上每年我们都会在生信技能树等公众号写多个教程分享WGCNA的实战细节，比如：

代码也是完全公开的，大家很容易复制粘贴到自己的表达量矩阵群，其实算起来WGCNA本身就一个函数而已，就是划分基因模块，其它都是附加分析。总体来说就是4个步骤：

合适的矩阵（一般来说，是多个基因或者其它特征指标在多个样品的矩阵）
运行WGCNA，对基因等特征划分模块
计算模块和样品其它属性的相关性
对模块进行go或者kegg等数据库注释搞清楚模块的功能

合适的矩阵

前面的院士课题组的WGCNA数据挖掘文章能复现吗教程里面，我们拿到了转录组差异分析后的上下调基因列表，然后目前的转录组测序表达量矩阵里面的基因表达量是整数格式的counts值，并不适合做后续的运行WGCNA，对基因等特征划分模块。需要一个简单的转换，代码如下所示：

rm(list = ls()) 
load( file = '../step1-deg/DEG_deseq2.Rdata' ) 
colnames(DEG_deseq2) 
nrDEG=DEG_deseq2[,c("log2FoldChange", "padj")] 
head(nrDEG) 
colnames(nrDEG)=c('logFC','P.Value')

# 凡是阈值，都是可以自定义 
logFC_t <- 2.5
pvalue_t <- 0.001
gene_up= rownames( nrDEG[with(nrDEG,
 logFC > logFC_t & P.Value < pvalue_t),])
gene_down=rownames( nrDEG[with(nrDEG,
 logFC < -logFC_t & P.Value < pvalue_t),]) 
length(gene_up);length(gene_down)
head(gene_up);head(gene_down)

load(file = '../step1-deg/symbol_matrix.Rdata') 
symbol_matrix[1:4,1:4] ## 基因名字的样品，矩阵
dat = log2(edgeR::cpm(symbol_matrix)+1)
# 这个归一化方法不太推荐
library(limma)
library(edgeR)
library(DESeq2) 
dge <- DGEList(counts=symbol_matrix)
dge <- calcNormFactors(dge)
logCPM <- cpm(dge, log=TRUE, prior.count=3)
design <- model.matrix(~0+factor(group_list))
colnames(design)=levels(factor(group_list))
rownames(design)=colnames(symbol_matrix)
design
v <- voom(dge,design,plot=TRUE, normalize="quantile")
dat = v$E

dat[1:4,1:4]
boxplot(dat,las=2)
table(group_list)

kp = group_list=='case'
# 矩阵，样品过滤，基因过滤
dat = dat[c(gene_up,gene_down),kp]
dim(dat)

仅仅是因为前面的院士课题组的WGCNA数据挖掘文章能复现吗，它是先差异分析，然后做wgcna，并不代表我们一定要这样做，如何过滤基因都是可以有自己的考虑，言之有理即可，也可以是简简单单基因sd或者mad的排序后取top 5000或者其它数量级的基因列表做后续的wgcna

然后运行WGCNA，对基因等特征划分模块

运行WGCNA之前需要确定一下软阈值，当然了，这个步骤也是可以自由修改的，


#1.确定软阈值----
library(WGCNA)
dat0 <- t(dat)

powers = c(c(1:10), seq(from = 12, to=20, by=2))
# Call the network topology analysis function
sft = pickSoftThreshold(dat0, 
 powerVector = powers, 
 verbose = 5)
po <- sft$powerEstimate;po

# Plot the results:
sizeGrWindow(9, 5)
par(mfrow = c(1,2));
cex1 = 0.9;

# Scale-free topology fit index as a function of the soft-thresholding power
plot(sft$fitIndices[,1], 
 -sign(sft$fitIndices[,3])*sft$fitIndices[,2],
 xlab="Soft Threshold (power)",
 ylab="Scale Free Topology Model Fit,signed R^2",
 type="n",
 main = paste("Scale independence"));
text(sft$fitIndices[,1], 
 -sign(sft$fitIndices[,3])*sft$fitIndices[,2],
 labels=powers,cex=cex1,col="red");

# this line corresponds to using an R^2 cut-off of h
abline(h=0.90,col="red")

# Mean connectivity as a function of the soft-thresholding power
plot(sft$fitIndices[,1], 
 sft$fitIndices[,5],
 xlab="Soft Threshold (power)",
 ylab="Mean Connectivity", 
 type="n",main = paste("Mean connectivity"))
text(sft$fitIndices[,1], 
 sft$fitIndices[,5], 
 labels=powers, cex=cex1,col="red")

#2.一步构建网络----
# 报错：https://blog.csdn.net/liyunfan00/article/details/91686840
cor <- WGCNA::cor
net = blockwiseModules(dat0, power = po,
 TOMType = "unsigned", minModuleSize = 30,
 reassignThreshold = 0, mergeCutHeight = 0.25,
 numericLabels = TRUE, pamRespectsDendro = FALSE,
 saveTOMs = F, 
 verbose = 3) #一步构建网络
#改回去
cor<-stats::cor

class(net)
names(net)
table(net$colors)

#(1)保存net相关信息
moduleLabels = net$colors
moduleColors = labels2colors(net$colors)
MEs = net$MEs;
geneTree = net$dendrograms[[1]];
save(net,MEs, moduleLabels, moduleColors, geneTree, 
 file = "Step2networkConstruction-auto.RData")

可以看到，模块划分的非常棒啊：

模块划分的非常好

可以看到是10个模块，每个模块都有几百个基因：

 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 
509 993 515 341 290 272 209 197 160 122

简简单单的 blockwiseModules 函数就完成了wgcna分析

计算模块和样品其它属性的相关性

模块是基因的合集，它可以有自己的值，也是跟基因一样的在每个样品都有一个计算好的值。同时呢，每个样品也有其它属性，比如病人就可以有年龄，体重等等，肿瘤病人还有tnm和stage信息，比如下面的代码，我们选择了肿瘤病人的转移与否这个二分类变量，取跟前面的模块进行关联分析

#1.Modules-traits relationships----
# Define numbers of genes and samples
dat <- t(dat)
nGenes = ncol(dat)
nSamples = nrow(dat)

# Recalculate MEs with color labels
MEs0 = moduleEigengenes(dat, moduleColors)$eigengenes
MEs0[1:6,1:6]

MEs = orderMEs(MEs0)
MEs[1:6,1:6]

phe = data.table::fread('TCGA-CHOL.GDC_phenotype.tsv.gz',data.table = F)
colnames(phe)
phe=phe[match(rownames(dat),phe$submitter_id.samples),]
# [41] "pathologic_M" 
# [42] "pathologic_N" 
# [43] "pathologic_T" 
group_list = phe$pathologic_M
table(group_list)
group_list=ifelse(group_list=='M0','non','M')
group_list=as.factor(group_list)
# 肿瘤，tmn，stage。。。。

design=model.matrix(~0+ group_list)
colnames(design)=levels(group_list)
moduleTraitCor = cor(MEs, design, use = "p")
head(moduleTraitCor)

moduleTraitPvalue = corPvalueStudent(moduleTraitCor, 
 nSamples)
head(moduleTraitPvalue)

#可视化
sizeGrWindow(10,6)

# Will display correlations and their p-values
textMatrix = paste(signif(moduleTraitCor, 2), 
 "\n(",signif(moduleTraitPvalue, 1),
 ")", 
 sep = "");
dim(textMatrix) = dim(moduleTraitCor)
textMatrix[1:6,1:3]

par(mar = c(3, 12, 3, 1));
# Display the correlation values within a heatmap plot
design1 <- as.data.frame(design)
labeledHeatmap(Matrix = moduleTraitCor,
 xLabels = names(design1),
 yLabels = names(MEs),
 ySymbols = names(MEs),
 colorLabels = FALSE,
 colors = blueWhiteRed(50),
 textMatrix = textMatrix,
 setStdMargins = FALSE,
 cex.text = 1,
 zlim = c(-1,1),
 main = paste("Module-trait relationships"))

可以看到，有两个模块跟我们的肿瘤转移是正相关，一个模块是负相关，如下所示：

肿瘤转移的模块

最后就是对模块进行go或者kegg等数据库注释搞清楚模块的功能

前面我们知道了有两个模块跟我们的肿瘤转移是正相关，一个模块是负相关，而且也知道了模块里面的基因是什么，但是基因那么多我们没办法描述它，通常是需要对各个模块里面的基因进行go或者kegg等数据库注释搞清楚模块的功能。代码也是很简单的：

rm(list = ls()) ## 魔幻操作，一键清空~
options(stringsAsFactors = F)
library(WGCNA)
load( file = "Step2networkConstruction-auto.RData")

table(moduleColors)
group_g=data.frame(gene=names(net$colors),
 group=moduleColors)
head(group_g)
#save(group_g,file='wgcna_group_g.Rdata') 
library(clusterProfiler)
# Convert gene ID into entrez genes
head(group_g)
tmp <- bitr(group_g$gene, fromType="SYMBOL", 
 toType="ENTREZID", 
 OrgDb="org.Hs.eg.db")
de_gene_clusters=merge(tmp,group_g,by.x='SYMBOL',by.y='gene')
table(de_gene_clusters$group)
head(de_gene_clusters)

gcSample <- split(de_gene_clusters$ENTREZID, 
 de_gene_clusters$group) 
xx <- compareCluster(gcSample, fun="enrichKEGG",
 organism="hsa", pvalueCutoff=0.05)
dotplot(xx)

如下所示，我们不仅仅是是知道了有两个模块跟我们的肿瘤转移是正相关，而且知道了这两个模块的功能是细胞恶性增殖以及细胞迁移，完美的对应了肿瘤的恶性转移。

肿瘤的恶性转移

我们这里并没有去重复院士团队的WGCNA挖掘文章，而是自作主张的把它修改成为癌症转移与否关键模块，结果也挺好的。

相比大家也懂我们为什么没有去重复院士团队的WGCNA挖掘文章的细节。代码这里给大家，感兴趣的可以去读一下，蛮有意思的：https://cowtransfer.com/s/9c88947d74bf4b 点击链接查看 [ 2023-浙江大学李兰娟院士-WGCNA数据挖掘.zip ] ，或访问奶牛快传 cowtransfer.com 输入传输口令 whhffg 查看；

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合适的矩阵

然后运行WGCNA，对基因等特征划分模块

计算模块和样品其它属性的相关性

最后就是对模块进行go或者kegg等数据库注释搞清楚模块的功能