流式细胞筛选能保证多大程度的细胞亚群纯度呢

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通常大家会选择流式细胞仪（Flow Cytometry）这种技术，来纯化特定单细胞亚群。但是流式细胞筛选并不能保证百分百的效率哦，甚至说有时候都达不到50%，我们来使用几个案例说明一下：

乳腺癌筛选t细胞接近百分百

首先看2018的cell杂志的文章：《Single-Cell Map of Diverse Immune Phenotypes in the Breast Tumor Microenvironment》
有两个流式细胞筛选操作，所以有两个单细胞转录组数据集：

  • fluorescence-activated cell sorting (FACS)-purified CD45+ cell populations were subjected to single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) using the inDrop platform
  • FACS-sorted CD3+ T cells （paired 50 scRNA-seq and TCR-seq data from 10x）
    其中10x技术的单细胞转录组是专门针对t细胞的，数据集是：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE114724

    GSM3148575 BC09_TUMOR1
GSM3148576 BC09_TUMOR2
GSM3148577 BC10_TUMOR1
GSM3148578 BC11_TUMOR1
GSM3148579 BC11_TUMOR2
GSM3148580 BC09_TUMOR1_TCR
GSM3148581 BC09_TUMOR2_TCR
GSM3148582 BC10_TUMOR1_TCR
GSM3148583 BC11_TUMOR1_TCR
GSM3148584 BC11_TUMOR2_TCR

    下载页面的表达量矩阵后进行降维聚类分群可以看到基本上就全部都是t细胞本身，没有其它混杂。
    乳腺癌是发生在乳腺组织的恶性肿瘤，它是全球女性中最常见的癌症之一。乳腺癌的发展涉及乳腺细胞的基因突变和癌变，这些癌变的细胞可以不受控制地增殖，形成肿瘤。乳腺癌的类型多种多样，主要根据肿瘤细胞的形态和它们产生的特定蛋白质来分类。一些常见的乳腺癌类型包括：

  1. 浸润性导管癌：这是最常见的乳腺癌类型，起源于乳腺的导管。
  2. 浸润性小叶癌：起源于乳腺小叶，小叶是产生乳汁的腺体。
  3. 导管原位癌：这是一种非侵袭性的乳腺癌，癌细胞限于乳腺导管内。
  4. 小叶原位癌：与导管原位癌类似，但发生在乳腺小叶内。
  5. 炎性乳腺癌：这是一种罕见且侵袭性强的癌症，癌细胞阻断了淋巴管，导致乳房皮肤红肿。
  6. 三阴性乳腺癌：这种癌症不表达雌激素受体、孕酮受体和HER2蛋白，因此被称为“三阴性”。
    乳腺癌的肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）是指肿瘤细胞周围的环境，它对肿瘤的生长、侵袭和转移具有重要影响。肿瘤微环境包括：
  7. 成纤维细胞：这些细胞产生细胞外基质，影响肿瘤的硬度和结构。
  8. 免疫细胞：如肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和淋巴细胞，它们可以促进或抑制肿瘤的生长。
  9. 血管：肿瘤诱导生成新的血管（血管生成）以提供必要的营养和氧气。
  10. 细胞外基质：由胶原蛋白、蛋白多糖和弹性蛋白等组成，影响细胞的粘附、迁移和信号传递。
  11. 信号分子：包括生长因子、细胞因子和趋化因子，它们在细胞间通讯中起作用。
  12. 代谢物和气体：如乳酸和一氧化氮，它们可以影响免疫细胞的功能。
    乳腺癌的肿瘤微环境在癌症的进展中扮演着复杂的角色。它不仅可以支持肿瘤细胞的生长，还可以通过促进血管生成、免疫逃逸和细胞外基质重塑来帮助肿瘤的侵袭和转移。了解肿瘤微环境的组成和功能对于开发新的治疗策略至关重要。

    SLE病人筛选b细胞接近90%

    是2020的文章：《CD52 Is Elevated on B cells of SLE Patients and Regulates B Cell Function》，配套数据集是：GSE163121，实验设计很简单的，就是 Single-cell RNA sequencing of HC (n=2) and SLE (n=3), 但是我看了看文章里面并没有提到是如何人为的筛选b细胞的，两分组就是简简单单的差异分析就好了：

  • we found a significant expansion of the ITGAX (CD11c) and TBX21 (T-bet) expressing double negative switched memory B cell subset (DN2) in SLE patients that exhibited a strong interferon signature
  • multiple B cell clusters from SLE patients exhibited significantly increased expression of interferon- stimulated genes including IFI44L and ISG15
    我们可以下载它的表达量矩阵走下游单细胞转录组的降维聚类分群哈，如下所示：
    image-20240512101926487
    可以看到，里面的b细胞其实是占比超过了90%。
    系统性红斑狼疮（Systemic Lupus Erythematosus，简称SLE）是一种慢性自身免疫性疾病，其特点是体内产生多种自身抗体，导致多系统、多器官的炎症性损伤。SLE的病因复杂，涉及遗传、环境、激素和免疫因素。临床表现多样，包括关节炎、皮疹（尤其是面部蝶形红斑）、肾炎、血液系统异常、浆膜炎、神经系统症状等。SLE好发于育龄期女性，且在不同种族和地区之间存在发病率和临床表现的差异。近年来，单细胞测序技术（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）在SLE研究中取得了重要进展。这项技术能够揭示SLE患者体内细胞的异质性，识别特定细胞亚群的分子特征，从而为理解SLE的复杂病理过程提供了新的视角。以下是一些关于SLE病人的单细胞研究的关键发现：
  1. 免疫细胞异质性：通过单细胞测序，研究人员能够区分并分析SLE患者体内的不同免疫细胞亚群，如T细胞、B细胞、单核细胞和树突状细胞等，揭示它们在疾病中的作用。
  2. 细胞状态和功能：单细胞分析有助于识别SLE患者中细胞的激活状态、增殖能力和功能变化，如B细胞的异常活化和自身抗体产生，以及T细胞的免疫调节失衡。
  3. 分子和遗传关联：单细胞测序技术可以用来研究SLE患者细胞的基因表达模式，发现与疾病相关的分子途径和遗传变异，为治疗提供潜在靶点。
  4. 疾病亚型和预后：通过单细胞数据，研究人员能够识别SLE的不同亚型，并与临床表现和疾病活动性相关联，有助于疾病的分层管理和预后评估。
  5. 治疗反应：单细胞测序还可以用于评估SLE患者对治疗的反应，如药物治疗对免疫细胞群体的影响，从而指导个性化治疗策略的制定。
  6. 疾病监测和生物标志物：单细胞测序有助于发现SLE的生物标志物，这些标志物可用于疾病监测、早期诊断和治疗反应的评估。
    综上所述，单细胞测序技术在SLE研究中的应用前景广阔，它不仅增进了我们对SLE病理机制的理解，还为临床诊断、治疗和新药开发提供了重要信息。随着技术的不断进步和应用的深入，未来有望为SLE患者提供更精准的诊断和个性化治疗方案。

    胃癌病人筛选treg细胞不到70%

    是2021的文章：《The effects of TNF-α/TNFR2 in regulatory T cells on the microenvironment and progression of gastric cancer》，对应的数据集是GSE172131，关键的流式细胞筛选标准是：CD4 CD25highCD127 Tregs were sorted by FACS (BD FACS Aria III).
    我们可以下载它的表达量矩阵走下游单细胞转录组的降维聚类分群哈，如下所示：
    image-20240512102133191
    统计里面的不同单细胞亚群的数量，可以看到筛选treg细胞不到70%。
    胃癌（Gastric Cancer）是发生在胃部的恶性肿瘤，它是全球最常见的癌症之一。胃癌的发展通常涉及胃部细胞的基因突变和癌变，这些癌变的细胞可以不受控制地增殖，形成肿瘤。胃癌的病因可能包括多种因素，如：

  7. 幽门螺杆菌感染：这是一种常见的细菌感染，可以引起慢性胃炎，增加胃癌的风险。
  8. 饮食习惯：高盐、高脂、腌制食品和烟熏食品的摄入与胃癌的风险增加有关。
  9. 吸烟：吸烟是多种癌症的风险因素，包括胃癌。
  10. 遗传因素：有家族胃癌史的人群患胃癌的风险较高。
  11. 胃部慢性疾病：如慢性胃炎、胃溃疡等也可能增加胃癌的风险。

    SLE病人筛选b细胞不到50%

    是2022的文章：《IL-4-Induced Quiescence of Resting Naive B Cells Is Disrupted in Systemic Lupus Erythematosus》，也是写的很清楚做了b细胞的流式细胞筛选哦，数据集是GSE136035，如下所示：
    image-20240512102410066
    但是如果你下载它的表达量矩阵走下游单细胞转录组的降维聚类分群哈，如下所示：
    image-20240512102446942
    可以看到里面仍然是有大量的其它单细胞亚群，这个比例发布给人的感觉就是普普通通的pbmc了，并没有经过任何的流式细胞筛选操作，或者筛选失败了。

    是否可能更低呢

    虽然我做了两千多个单细胞转录组项目，里面确实是很多研究都选择了流式细胞进行明白单细胞亚群的纯化，但是我还没有看到过筛选到目标单细胞亚群占比低于50%的。可能是因为如果真的是低于50%， 可以干脆说没有经过流式细胞操作吧。流式细胞术（Flow Cytometry）是一种用于检测和测量细胞特性的技术，它能够对单细胞进行快速、高精度的分析和分类。在使用流式细胞术筛选目标单细胞亚群时，可能会得到不同的纯度结果，这可能由以下几个因素导致：

  12. 抗原表达水平差异：不同细胞亚群可能在特定表面抗原的表达水平上存在差异，如果抗原表达差异较小，可能难以区分和纯化目标细胞。
  13. 补偿设置不当：在多色流式细胞术中，需要对荧光补偿进行精确设置，以避免不同荧光通道之间的光谱重叠。补偿设置不当可能导致细胞群的误分。
  14. 细胞内环境异质性：细胞在不同的生理或病理状态下，其内部环境可能发生变化，这可能影响抗原的表达和检测。
  15. 样本制备问题：样本处理过程中的任何不一致性，如细胞固定、渗透、染色等步骤，都可能影响最终的细胞纯度。
  16. 仪器性能：流式细胞仪的光学和流体系统性能对结果的准确性有直接影响。仪器的校准和维护不当可能导致结果偏差。
  17. 操作者经验：操作者对实验流程的熟悉程度和操作技巧也会影响结果的一致性和可重复性。
  18. 细胞周期阶段：细胞在不同的细胞周期阶段可能呈现不同的特性，这可能影响某些表面或内部抗原的检测。
  19. 细胞死亡和碎片：在样本制备和分析过程中，细胞可能发生死亡或产生碎片，这些因素可能干扰流式细胞术的分析。
  20. 抗体质量：使用的抗体的特异性和亲和力对流式细胞术的结果至关重要。抗体质量不佳可能导致非特异性结合或低信号。
  21. 数据分析算法：使用的分析软件和算法可能影响对细胞群的识别和分离。
    为了提高流式细胞术筛选目标单细胞亚群的纯度，需要仔细控制实验条件，使用高质量的试剂和抗体，以及进行精确的仪器校准和数据分析。
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