敲减过表达前后转录组差异最好是都做一下

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转录组测序（RNA-Seq）是一种高通量测序技术，可以在全基因组水平上定量分析细胞中所有mRNA的表达水平。通过比较基因过表达或敲减前后的转录组数据，研究人员可以获得关于基因如何调控细胞过程的详细信息。这种方法可以揭示基因表达的变化，发现新的生物学标记，以及理解基因表达调控的复杂性。在生物学和医学研究中，对特定基因进行过表达（过表达，即让基因表达水平高于正常生理状态）或敲减（降低基因表达水平，包括完全敲除或部分抑制）是一种常用的功能性分析方法。通过这些技术，研究人员可以探究基因的功能以及它们在生物学过程或疾病发生中的作用。以下是进行这类实验的几个主要原因：

  1. 基因功能鉴定：通过过表达或敲减特定基因，研究人员可以观察到细胞表型或生物体的表型变化，从而推断该基因的生物学功能。
  2. 疾病机制研究：在疾病状态下，某些基因的表达水平可能会发生改变。通过模拟这些改变，研究人员可以更好地理解这些基因如何影响疾病的发展。
  3. 药物靶点发现：通过敲减基因表达并观察细胞对药物的敏感性变化，研究人员可以识别潜在的药物靶点。
  4. 信号通路分析：基因过表达或敲减可以帮助揭示基因间的相互作用以及它们在信号传导通路中的位置和作用。
    常见的转录组实验设计就是干扰一下目标基因，然后两分组每个组内3个样品，是因为早期转录组测序费用昂贵。如果是二十年前做一个转录组样品可能会过万的费用，十年前就千把块钱了，五年前就五六百块钱，现在就三百多块钱了。详见：转录组价格腰斩哈！（优化升级后单个样本仅399元）
    所以，建议大家敲减过表达前后转录组差异最好是都做一下，向CNS期刊看齐！比如2024的CELL文章：《A TCF4-dependent gene regulatory network confers resistance to immunotherapy in melanoma》

    首先是过表达

    在其中一个黑色素瘤细胞系里面针对TCF4进行过表达，这样的话两分组就可以做差异分析。在热图里面很明显的可以看到过表达TCF4的效果：
    黑色素瘤细胞系里面针对TCF4进行过表达
    上面的两分组差异分析，如果仅仅是使用阈值（比如p值和变化倍数）来判断上下调基因，然后去对基因进行功能富集，就会漏掉上面的EMT通路。因为EMT通路的基因在这个转录组两分组差异结果里面并不会在上下调的两个极端，极大的放宽我们的阈值保留更多的上下调基因也很难精准的定位到EMT通路，反而是GSEA分析比较好！
    在基因表达数据的差异分析中，研究者通常使用一系列统计学指标来识别差异表达基因（Differentially Expressed Genes，DEGs）。以下是一些常用的统计学指标：

  5. P值（P-value）：表示统计检验中观察到当前结果或更极端结果的概率，通常用于假设检验。P值小于某个阈值（如0.05）通常被认为是统计显著的。
  6. Fold Change（FC）：即变化倍数，表示基因在两个条件或样本之间的表达水平比率。常用对数变化倍数（如log2 FC）来表示。
  7. t统计量（t-statistic）：在t检验中使用的统计量，用于比较两组样本均值是否有显著差异。
  8. 效应量（Effect Size）：衡量变量效应的大小，对于基因表达数据，常用的效应量包括标准化均值差（Standardized Mean Difference）。
  9. 假发现率（False Discovery Rate，FDR）：在多重假设检验中，FDR控制了错误发现的比例，常用的FDR控制方法有Benjamini-Hochberg程序。
  10. q值：与FDR类似，q值也是一个用于多重检验校正的统计量，它提供了对错误发现概率的直接估计。
  11. 信噪比（Signal-to-Noise Ratio，S2N）：衡量信号强度与背景噪声比率的指标，用于评估基因表达差异的可靠性。
  12. B统计量（B-statistic）：在非参数检验中使用，如Mann-Whitney U检验，用于比较两组样本的中位数是否有显著差异。
  13. AUC（Area Under the Curve）：接收者操作特征曲线（ROC Curve）下的面积，用于评估分类器的性能。
  14. π值（Pi-value）：结合了变化倍数和P值的基因显著性评分，用于改善基因排名。
    这些统计学指标可以单独使用，也可以组合使用，以提供更全面的基因表达差异分析。在实际应用中，研究者会根据数据的特性、实验设计和研究目标选择合适的统计方法和指标。

    然后是敲减

    在其中一个黑色素瘤细胞系里面针对TCF4进行敲减，同样的两分组就可以做差异分析。在热图里面很明显的可以看到过敲减TCF4的效果：
    针对TCF4进行敲减

    为什么是两个不同细胞系呢

    因为黑色素瘤有很多不同的细胞系模型，它们代表了不同的分子分型。

  • we silenced TCF4 in melanoma lines (MM099 and MM047) harboring a MES phenotype, expressing high levels of TCF4
  • Genes downregulated upon TCF4 knockdown (KD) were involved in cellular movement, EMT, integrin signaling, and angiogenesis
  • Conversely, TCF4 overexpressed in MEL melanoma cell lines (Ma-Mel-86c and MM011),
    黑色素瘤（Melanoma）是一种由黑色素细胞发展而来的恶性肿瘤，它可以发生在皮肤、黏膜、眼睛的葡萄膜等部位。在黑色素瘤的研究和治疗中，了解肿瘤细胞的不同表型和状态对于确定治疗方案和预测治疗效果非常重要。
  1. MES（间充质样状态）：在黑色素瘤的背景下，MES通常指的是肿瘤细胞呈现出的一种间充质样表型，这种状态下的细胞具有较高的迁移和侵袭能力。在一些研究中，MES状态的黑色素瘤细胞被发现与免疫逃逸相关，它们可能表达较低水平的免疫相关分子，从而减少免疫系统对肿瘤的识别和攻击。此外，MES状态的黑色素瘤细胞可能与对某些治疗如免疫检查点阻断（ICB）疗法的耐药性有关。
  2. MEL（黑色素细胞）类型：MEL类型通常指的是黑色素细胞的特性，这些细胞负责产生黑色素，是皮肤色素沉着的主要细胞。在黑色素瘤的背景下，MEL类型可能指的是肿瘤细胞保留了一些黑色素细胞的特征，如黑色素的产生。这些细胞可能表达黑色素细胞特有的标志物，如MITF、TYR、MART-1等。MEL状态的细胞可能与肿瘤的某些生物学行为相关，如对特定药物的敏感性或免疫治疗的反应性。
    在黑色素瘤的治疗中，针对MES和MEL状态的细胞可能需要不同的策略。例如，针对MES状态的细胞，可能需要考虑使用能够抑制其侵袭和迁移能力的治疗方法，或者寻找能够增强免疫系统对这些细胞识别的方法。而对于MEL状态的细胞，则可能需要考虑利用其黑色素细胞的特性来开发新的治疗方法。值得注意的是，黑色素瘤的异质性很高，肿瘤内部的细胞可能同时存在多种不同的表型和状态，这给治疗带来了复杂性。因此，深入理解这些不同的细胞状态对于开发更有效的治疗策略至关重要。
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