胰腺癌的不同疾病进展期单细胞转录组-2020年9月份第1周（总第129周 ）

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胰腺癌的不同疾病进展期单细胞转录组

胰腺癌的单细胞转录组这篇文章发在 Clin Cancer Res. 2018 Nov 1. 题目很长，是 Single Cell Transcriptomics of Pancreatic Cancer Precursors Demonstrates Epithelial and Microenvironmental Heterogeneity as an Early Event in Neoplastic Progression.
该研究是大名鼎鼎的 MD Anderson Cancer Center (MDACC) 做的，使用的是10X流派的drop-seq技术（illumina的ddSEQ仪器），检测了 5,403 cells from two low-grade IPMNs (LGD-IPMN), two high-grade IPMNs (HGD-IPMN), and two PDACs (这6个病人 all surgically resected).。有点类似于那篇 PDAC癌前病变 文章 Published: 03 September 2018 ，题目是；Precancerous neoplastic cells can move through the pancreatic ductal system 胰腺癌的早起检测仍然是难以捉摸的，PDAC的前体病变，特别是导管内乳头状粘液性肿瘤（IPMN）代表了侵袭性肿瘤的真正途径，尽管进展的分子相关性仍有待完全阐明。
本文主要研究的是胰腺癌前体的上皮性和微环境异质性。单细胞转录组学为解析伴随从非侵入性IPMN到PDAC的多步骤进展的上皮和微环境异质性提供了独特的途径。

背景介绍

胰腺，是“隐居”于我们身体上腹部深处的一个非常不显眼的小器官。器官虽小但作用非凡，可以说是人体中最重要的器官之一，它的生理作用和病理变化与生命息息相关。在整个消化道内，胰腺是最重要的分泌腺之一，兼有内外分泌的双重功能。

  • 外分泌—消化功能：胰腺分泌的胰液中含有大量的酶，在消化食物的过程中担任“主角”，所以胰腺一旦闹情绪，首要问题就是消化不良。
  • 内分泌—代谢功能：胰腺还负责分泌胰岛素，维持人体血糖稳定。若是胰岛素分泌不足，糖尿病就会随之而来，还会引发心血管等疾病，麻烦会接踵而至。
    胰腺癌并不是人类常见恶性肿瘤，占人体所有癌瘤的1～2%，但其死亡率非常高。胰腺癌早期无明显和特异的症状和体征，很难早发现，使许多患者被误诊。很多胰腺癌患者确诊时已属中晚期，并且有局部或远处转移，仅有不到10％ 的患者有手术机会。胰腺癌是一种预后极差的恶性肿瘤，5年生存率仅为5% ，因此被称为“癌中之王”。
    胰腺癌是一种高度恶性的消化系统肿瘤，临床上以导管细胞来源的胰腺癌(PDAC)居多。在PDAC中，KRAS是胰腺癌中突变最早且几率最大的基因，>90％的患者存在KRAS基因突变。

    单细胞转录组

    表达分类的tSNE图

    总共是6个病人， 样品是2个LG,2个HG,2个PDAC， 总共是3343个细胞的全局单细胞转录组表达tSNE图，根据样品标记可以看到不同样品的细胞会混在一起，也会分很开，通常我们的经验是，肿瘤恶性细胞是具有病人异质性的，通常不会聚到一起。聚在一起成为不同类别的往往是免疫细胞等肿瘤微环境细胞。
    tSNE-tissues-expression-types.png
    聚集在一起的，研究人员就根据他们高表达的基因集来进行定义细胞类型，同样的颜色区别。
    然后对其中一些特征基因显示表达量在不同细胞类型分组的高低情况，如下：
    tSNE-expression-of-some-genes.png
    同样是基于PDAC的背景知识，展示一些它的marker：
    violin-of-expression-of-some-genes.png
    还是有很明显的差异，可以看到PDAC样品均搞表达，而LG和HG作为PDAC的癌前病变，也是有部分细胞会表达PDAC的标记基因。

    细胞周期推断

    这里作者对log2TPM矩阵使用MSigDB数据库的GO子库的 G1,G2,M,S 计算得分后绘制热图：
    cell-cycles-heatmap.png
    可以看到PDAC样品比LG和HG的细胞活动要强烈，集中于G2/M and S周期。

    差异基因热图

    有了细胞分类，就可以提取各自细胞类型的差异基因作为其细胞特征，绘制热图如下：

    Heatmap of the top 20 differentially expressed genes used to identify cell phenotypes across each of the ten discrete clusters indicated by the header.
    heatmap-of-top-genes-of-clusters.png
    值得注意的是LG的上皮细胞可以显著分成3类，

    肿瘤基质细胞继续分型

    通常是要排除那些肿瘤细胞，可以根据CNV来，也有上面提到的PDAC标记分子，得到的基质细胞是一个混合体，通常是免疫细胞，内皮细胞，癌症相关成纤维细胞，肌成纤维细胞(myofibroblast)
    这些细胞在不同病人的比例是本文的重中之重。
    tSNE-stromal-cells.png
    同样的，这些细分群体也有自己的marker，可以绘制热图如下：
    heatmap-stromal-cells.png
    当然，也可以对每个细胞群体继续展示其marker的表达分布情况，这里就不讲述了。

    提出模型

    全文精华：
    提供对胰腺癌病人的不同进展时期：LGD-IPMN, HGD-IPMN, and PDACs, 进行单独的单细胞转录组测序，分析其细胞组成的异质性，刻画了疾病进展过程中的细胞类型，通路的转换，如下：
    model-of-evolution-PDAC.png

    胰腺癌单细胞相关研究现状

    糖尿病人的胰岛器官的单细胞图谱 ,Cell Metab. 2016 Oct 11; 题目是：Single-Cell Transcriptome Profiling of Human Pancreatic Islets in Health and Type 2 Diabetes
    胰腺器官的单细胞图谱，A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Human Pancreas DOI:https://doi.org/10.1016/j.cels.2016.09.002 使用的是 FACS 和 CEL-Seq2技术 。
    胰腺癌（PDAC）单细胞转录组测序的同时保留空间信息：https://www.biorxiv.org/content/early/2018/03/05/254375 这篇文章没有正式发表，所以关于它的评价也很精彩：https://www.bioverlay.org/post/pancreatic-cancer-cell-atlas-feb-2018/
    抢先公告的摘要：AACR Annual Meeting 2018; April 14-18, 2018; Chicago, IL http://cancerres.aacrjournals.org/content/78/13_Supplement/5353 他们研究团队使用的是 10X Genomics 他们的结论平淡无奇，居然是单细胞能揭示胰腺癌的异质性， 而对异质性的认知会指导治疗。
    另外一个海报抢先版：Poster Presentation, PO-277 Single-cell RNA-seq analysis of human pancreatic ductal adenocarcinoma ， https://esmoopen.bmj.com/content/3/Suppl_2/A336.1 也是10X 平台的：HiSeq4000 (3,640 cells; over 10^5 reads per cell).
    还有一篇是 Single-Cell Transcriptomic Analysis of Tumor-Immune Microenvironment in Pancreatic Cancer，http://www.jimmunol.org/content/200/1_Supplement/178.40 没看到全文。

    胰腺癌WES相关研究

    最出名的两个大的队列是：

  • NC发表了美国科学家对109名胰腺导管腺癌（PDA）病人进行了全外显子测序，发现了PDA中的基因突变多样性，并且为发现PDA治疗靶点提供了重要信息。在该项研究中，研究人员为方便检测基因突变，同时移除非肿瘤性组织的污染，他们利用显微切割的方法将癌症患者的肿瘤组织进行了异种移植并建立了细胞系。随后对109例进行过显微切割的PDA病例进行了全外显子测序，经过显微切割操作后，肿瘤细胞得到富集并增强了对基因突变的检测。
  • nature发表了澳大利亚科学家的一项最新研究进展，他们通过对胰腺癌病人进行全基因组测序以及CNV分析重新定义了胰腺癌突变图谱。研究人员对100个胰腺导管腺癌（PDAC）病人进行了全基因组测序以及copy number variation（CNV）分析，结果发现染色体重排导致的基因破坏在胰腺癌病人中普遍存在，这会影响导致胰腺癌发生的关键基因比如TP53，SMAD4，CDKN2A，ARID1A和ROBO2，同时还会影响一些新的胰腺癌驱动因子比如KDM6A和PREX2。研究人员提出，根据结构变化的模式不同，可将PDAC分为具有潜在临床应用价值的4个亚型：稳定型，局部重排型，零散型和不稳定型。
    还有一些GWAS探索易感基因的， 就不罗列了。

    胰腺癌相关RNA-seq研究

    附件

  • Figure S3 - Feature Plot of characteristic genes plotted across tSNE clusters demonstrating stromal phenotypes.
  • Figure S4 - Correlation heatmap of Pearson correlation coefficients of hierarchically clustered individual cells across stromal populations identified by originating lesion type and tSNE cluster suggests multiple unique subtypes.
  • Figure S5 - Tapestation traces following (A) cDNA amplification of single cell and (B) library construction demonstrating sufficient quality and yield of material. Vertical lines demonstrate regions utilized to calculate cDNA and library yield through area under the curve.
  • Table S1 - Patient characteristics
  • Table S2 - Cell phenotype gene list
  • Table S3 - Differentially expressed genes across all clusters
  • Table S4 - Pancreatic cancer core signaling pathways across lesion types
  • Table S5 - Pathway analysis among lesions
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