植物种子发育转录调控-2020年8月份第4周（总第128周 ）

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本次分析的文章发表在Plant Cell. 2019 May; 题为‘High-temporal-resolution Transcriptome Landscape of Early Maize Seed Development’的学术论文。该研究通过对玉米珠心(包括胚囊)进行RNA-seq分析，绘制了高时间分辨率的玉米籽粒发育早期转录组图谱。 需要注意的是 days after pollination (DAP) 和 hours after pollination (HAP)
早在2008年，就有研究者使用表达芯片技术，探索过6个时间点的玉米种子发育过程的转录调控变化细节。2013和2014也分别有研究团队使用RNA-seq技术探索。具体不是我的研究领域，懒得翻译了。总之，由于之前的转录组研究没有足够的时间分辨率，可能有多个只在特定发育阶段短时间表达、但对籽粒早期发育很重要的基因没有得到解析。作者这个研究是目前为止涉及到的时间点最多的，可以检测到22,790 genes, including 1415 transcription factors (TFs),的动态变化，其中1093 genes, including 110 TFs是有统计学特异性的表达在某个发育阶段。

4个发育阶段

对RNA-seq数据的转录表达谱进行主成分分析还有层次聚类，都可以清晰的看到玉米种子发育早期的31个时间点，可以清晰的分成4个发育阶段：

  • 双受精(double fertilization)
  • 多核形成(coenocyte formation)
  • 细胞化(cellularization)
  • 分化(differentiation)
    示意图如下：
    image-20190820122035262

    每个阶段都有特异性高表达基因

    在玉米种子早期发育阶段共有22790个基因表达，包括1415个转录因子。其中，有1093个基因（包括110个转录因子）只在种子中特异性的表达；这里面大部分基因是在本次研究中被发现的，而且它们具有高度的时间表达特性，也就是说它们只在种子发育的特定阶段表达。后面会进行细致的注释和解释。
    可以看到，在授粉后的前16小时、胚乳游离核期、细胞化和分化阶段分别鉴定到了160、22、112和569个籽粒特异性基因。
    | Developmental Stage | No. of Genes/TFs | No. of Specific Genes/TFs |
    | :———————————————————- | :—————————- | :—————————————— |
    | Around double fertilization (0 ∼ 16 HAP) | 4,453/414 | 160/18 |
    | Coenocyte (20 ∼ 44 HAP) | 1,285/53 | 22/1 |
    | Cellularization (48 ∼ 96 HAP) | 2,569/125 | 112/7 |
    | Differentiation (102 ∼ 144 HAP) | 3,614/224 | 569/60 |
    | Other | 10,869/599 | 230/24 |
    | Total | 22,790/1,415 | 1,093/110 |
    以表达量随着时间变化的折线图表示：
    image-20190820122245515
    这里，其实可以借鉴单细胞转录组的分析及统计可视化技巧，比如在PCA图上面标记表达量热图，大家可以根据我的提示来尝试一下：
    image-20190820122344263

    每个发育阶段特异性表达基因的功能注释

    可以把每个发育阶段与其它数据进行差异分析，拿到独特的差异基因列表，然后绘图可视化展现如下：
    image-20190820122520574
    当然，也不能忽略大量基因在多个发育阶段出现，如下：

    We found that a total of 10,869 genes, including 599 TFs, in modules of M10 ; M18 were expressed at more than one of the four stages
    image-20190820122635037
    不同的发育阶段会有一些共同的生物学过程。
    值得一提的是，因为这里的数据是玉米物种，所以富集分析这里使用MapMan， Mapman是一款老牌但却持续更新的植物基因功能分析，通路分析的软件。做植物分子生物学研究，组学研究的工作者，应是都有所了解。反正我是不了解啦。
    Mapman除了对基因进行注释及表达数据可视化之外，还可以利用软件之际对多样品数据进行聚类分析。主要操作过程如下： 从Experiments导入表达数据,具体参考文章：植物代谢通路注释+基因表达可视
    文章里面的描述是：
    Functional category enrichment for each coexpression module was evaluated with the MapMan (v3.6.0) functional annotation

    使用MeV软件找基因共表达

    TIGR推出的微阵列分析软件包之一。MultiExperiment Viewer的缩写， 通用微阵列分析工具，运用各种算法对格式化好的微阵列数据进行聚类、统计、热图显示、分析。
    本研究作者就是采用MeV软件： we clustered all 22,790 expressed genes, including 1415 (6.2%) TFs into 18 coexpression modules using the k-means clustering algorithm。
    然后把这18个基因模块一个个描述它们的生物学意义， 其实我们通常是使用WGCNA来做这个分析，我估计作者应该是没有WGCNA的概念，就采用经典而且简单的MeV软件

    数据下载

    其中 RNA-seq data as FPKM values is available through the eFP Browser engine (http://bar.utoronto.ca/efp_maize/cgi-bin/efpWeb.cgi?dataSource=Early_Seed), 如果要下载原始数据，需要服务器去处理，在 PRJNA505095.
    作者使用hisat2软件把测序的fastq文件比对到玉米的B73参考基因组，然后用cufflinks计算基因的RPKM值，
    测序数据量不小：
    image-20190820145126152

    使用公共数据库

    作者这里在寻找种子特异性表达基因的时候，使用了公共数据，如下：
    image-20190820150756626

    调控网络

    研究者这里推断gene regulatory network (GRN)的方法参考两个文献
    image-20190820150940072
    该网络预测了1,317个转录因子和14,540个基因之间的31,256个相互作用。

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