Seurat包的findmarkers函数只能根据划分好的亚群进行差异分析吗

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前面我已经把全网第一个单细胞课程（基础课程）免费公布在了B站：https://www.bilibili.com/video/av38741055

虽然是免费的， 但是学员关于课程的提问，我还是会尽我所能帮忙的。当然，受限于时间和精力，只能是挑选重点和普适性的有价值的问题，比如其中一个问题是：

我发现我的目的基因主要分布在B细胞群，想问一下能不能通过是否表达目的基因将B细胞分成两群，再寻找差异表达基因呀？我看seurat包中，findmarkers的函数只要能找不同cluster 间的差异基因？

这个问题有两个解决方案，第一个把已经划分为B细胞群的那些细胞的表达矩阵，重新走seurat流程，看看这个时候它们是否根据有没有表达目的基因来进行分群，如果有，就可以使用 findmarkers函数。

另外一个解决方案，就是人为划分，然后强行走seurat标准流程。

首先看看 seurat标准流程

首先看看我们的seurat标准流程，自己去GEO数据库下载GSE125616的GSE125616_READ_COUNT_table_lvbo_TE_gencode.txt.gz文件，然后走下面的代码即可：

rm(list=ls())
options(stringsAsFactors = F)
library(data.table)
a=fread('GSE125616_READ_COUNT_table_lvbo_TE_gencode.txt.gz',
 header = T,sep = '\t',data.table = F)
hg=a$Geneid
dat=a[,7:ncol(a)]
rownames(dat)=hg
hg[grepl('^MT-',hg)]
head(hg)
library(stringr)
colnames(dat)
colnames(dat)=str_split(colnames(dat),'_',simplify = T)[,1]
meta=as.data.frame(str_split(colnames(dat),'_',simplify = T)[,1])

colnames(meta)=c('cell name') 
rownames(meta)=colnames(dat)
library(Seurat)
pbmc <- CreateSeuratObject(counts = dat, 
 meta.data = meta ,
 min.cells = 5, min.features = 1000, 
 project = "test")
pbmc
pbmc[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-")

sce=pbmc
sce <- NormalizeData(sce, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 10000)
GetAssay(sce,assay = "RNA")
sce <- FindVariableFeatures(sce, selection.method = "vst", nfeatures = 2000) 
# 步骤 ScaleData 的耗时取决于电脑系统配置（保守估计大于一分钟）
sce <- ScaleData(sce) 
sce <- RunPCA(object = sce, pc.genes = VariableFeatures(sce)) 
sce <- FindNeighbors(sce, dims = 1:15)
sce <- FindClusters(sce, resolution = 0.2)
table(sce@meta.data$RNA_snn_res.0.2)

set.seed(123)
sce <- RunTSNE(object = sce, dims = 1:15, do.fast = TRUE)
DimPlot(sce,reduction = "tsne",label=T)
phe=data.frame(cell=rownames(sce@meta.data),
 cluster =sce@meta.data$seurat_clusters)
head(phe)
table(phe$cluster)

可以看到， 走默认代码，划分的是5个亚群：

image-20200427100137617

这个时候，学员的问题可以简化为，不满意上图里面的0那个亚群，觉得它可以继续划分，比如根据感兴趣的目的基因，强行把0那个红色亚群继续划分为高低表达（或者是否表达）目的基因的亚群。

先熟悉FindMarkers函数

通常，我们使用FindMarkers函数针对感兴趣的细胞亚群，去寻找它与其它所有的亚群，表达有差异的基因，代码如下：


markers_df <- FindMarkers(object = sce, ident.1 = 0, min.pct = 0.25)
print(x = head(markers_df))
markers_genes = rownames(head(x = markers_df, n = 5))
VlnPlot(object = sce, features =markers_genes,log =T )
FeaturePlot(object = sce, features=markers_genes )

markers_df <- FindMarkers(object = sce, ident.1 = 1, min.pct = 0.25)
print(x = head(markers_df))
markers_genes = rownames(head(x = markers_df, n = 5))
VlnPlot(object = sce, features =markers_genes,log =T )
FeaturePlot(object = sce, features=markers_genes )

如果你仔细看这个FindMarkers函数的说明书，它其实是可以给定两个亚群，然后单独比较这两个亚群的。

## Default S3 method:
FindMarkers(
 object,
 slot = "data",
 counts = numeric(),
 cells.1 = NULL,
 cells.2 = NULL,
 features = NULL,
 reduction = NULL,
 logfc.threshold = 0.25,
 test.use = "wilcox",
 min.pct = 0.1,
 min.diff.pct = -Inf,
 verbose = TRUE,
 only.pos = FALSE,
 max.cells.per.ident = Inf,
 random.seed = 1,
 latent.vars = NULL,
 min.cells.feature = 3,
 min.cells.group = 3,
 pseudocount.use = 1,
 ...
)

所以，我们的目标就是把两个亚群信息，给到这个FindMarkers函数即可。当然了，这个差异分析结果表格也是需要理解的：

avg_logFC: log fold-chage of the average expression between the two groups. Positive values indicate that the gene is more highly expressed in the first group
pct.1: The percentage of cells where the gene is detected in the first group
pct.2: The percentage of cells where the gene is detected in the second group
p_val_adj: Adjusted p-value, based on bonferroni correction using all genes in the dataset

主要是借助统计可视化来。

根据高低表达（或者是否表达）目的基因划分亚群

其实在这个FindMarkers函数的说明书里面，就有一个现成的例子：

# Take all cells in cluster 2, and find markers that separate cells in the 'g1' group (metadata
# variable 'group')
markers <- FindMarkers(pbmc_small, ident.1 = "g1", group.by = 'groups', subset.ident = "2")
head(x = markers)

所以我们也是需要给单细胞数据对象，制作一个新的分组即可；

# 下面的 TP53 > 10 仅仅是我举例方便，你有自己感兴趣的基因，自己感兴趣的基因表达量阈值
highCells=colnames(subset(x = sce, subset = TP53 > 10, slot = 'counts'))
highORlow=ifelse(colnames(sce) %in% highCells,'high','low')
table(highORlow)
sce@meta.data$highORlow=highORlow
markers <- FindMarkers(sce, ident.1 = "high", 
 group.by = 'highORlow', 
 subset.ident = "0")
head(x = markers)

是不是很简单啊？

为什么我会挑选这个问题来解答呢，其实就是督促大家读说明书。

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