RNA-seq比对软件HISAT说明书

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取代bowtie+tophat进行RNA-seq比对

HISAT全称为Hierarchical Indexing for Spliced Alignment of Transcripts，由约翰霍普金斯大学开发。它取代Bowtie/TopHat程序，能够将RNA-Seq的读取与基因组进行快速比对。这项成果发表在3月9日的《Nature Methods》上。

HISAT利用大量FM索引，以覆盖整个基因组。以人类基因组为例，它需要48,000个索引，每个索引代表~64,000 bp的基因组区域。这些小的索引结合几种比对策略，实现了RNA-Seq读取的高效比对，特别是那些跨越多个外显子的读取。尽管它利用大量索引，但HISAT只需要4.3 GB的内存。这种应用程序支持任何规模的基因组，包括那些超过40亿个碱基的。

HISAT软件可从以下地址获取：http://ccb.jhu.edu/software/hisat/index.shtml。

首先，我们安装这个软件！

Wget http://ccb.jhu.edu/software/hisat/downloads/hisat-0.1.5-beta-source.zip

官网下载的是源码包，需要make一下，make之后目录下面就多了很多程序，绿色的那些都是，看起来是不是很眼熟呀！！！

哈哈，这完全就是bowtie的模拟版本！！！

HISAT取代bowtie+tophat进行RNA-seq比对1222

也可以从github里面下载，wget https://codeload.github.com/infphilo/hisat/zip/master

下载后直接解压即可使用啦。当然这个软件本身也有着详尽的说明书

http://ccb.jhu.edu/software/hisat/manual.shtml

然后就是准备数据，它跟tophat一样的功能。就是把用RNA-seq方法测序得到的fastq文件比对到参考基因组上面，所以就准这两个文件了哦

接下来是运行程序！

说明书上面写着分成两个步骤，构建索引和比对。

这个软件包模仿bowtie自带了一个example数据，而且它的说明书也是针对于那个example来的，我也简单运行一下。

$HISAT_HOME/hisat-build $HISAT_HOME/example/reference/22_20-21M.fa 22_20-21M_hisat

构建索引的命令如上，跟bowtie一样我修改了一下

/home/jmzeng/hoston/RNA-soft/hisat-0.1.5-beta/hisat-build 22_20-21M.fa  my_hisat_index

连日志都跟bowtie一模一样，哈哈，可以看到我们的这个参考fasta文件 22_20-21M.fa 就变成索引文件啦，索引还是很多的！

HISAT取代bowtie+tophat进行RNA-seq比对1871

然后就是比对咯，还是跟bowtie一样

$HISAT_HOME/hisat -x 22_20-21M_hisat -U $HISAT_HOME/example/reads/reads_1.fq -S eg1.sam

我的命令是

/home/jmzeng/hoston/RNA-soft/hisat-0.1.5-beta/hisat -x  my_hisat_index -U ../reads/reads_1.fq  -S reads1.sam

1000 reads; of these:

1000 (100.00%) were unpaired; of these:

0 (0.00%) aligned 0 times

1000 (100.00%) aligned exactly 1 time

0 (0.00%) aligned >1 times

100.00% overall alignment rate

哈哈，到这里。这个软件就运行完毕啦！！！是不是非常简单，只有你会用bowtie，这个就没有问题。当然啦，软件还是有很多细节是需要调整的。我下面就简单讲一个实际的例子哈！

首先，我用了1.5小时把4.6G的小鼠基因组构建了索引

/home/jmzeng/hoston/RNA-soft/hisat-0.1.5-beta/hisat-build  Mus_musculus.GRCm38.fa.fa mouse_hisat_index

HISAT取代bowtie+tophat进行RNA-seq比对2512

然后对我的四个测序文件进行比对。

for i in *fq

do

/home/jmzeng/hoston/RNA-soft/hisat-0.1.5-beta/hisat  -x  /home/jmzeng/hoston/mouse/mouse_hisat_index  \

-p 30 -U  $i.trimmed.single  -S ./hisat_out/${i%.*}.sam

done

它运行的速度的确要比tophat快好多，太可怕的速度！！！！至于是否多消耗了内存我就没有看了

4.6G的小鼠，5G的测序数据，我只用了五个核，居然十分钟就跑完了！

然后听群友说是因为没有加 --known-splicesite-infile <path>这个参数的原因，没有用gtf文件来指导我们的RNA数据的比对，这样是不对的！

需要用下面这个脚本把gtf文件处理一下，然后导入什么那个参数来指导RNA比对。

extract_splice_sites.py genes.gtf > splicesites.txt

但是我报错了，错误很奇怪，没解决，但是我换了个 extract_splice_sites.py  程序，就可以运行啦！之前是HISAT 0.1.5-beta release 2/25/2015里面的python程序，后来我换做了github里面的就可以啦！

/home/jmzeng/hoston/RNA-soft/hisat-master/extract_splice_sites.py Mus_musculus.GRCm38.79.gtf >mouse_splicesites.txt

HISAT取代bowtie+tophat进行RNA-seq比对3218

21192819 reads; of these:
21192819 (100.00%) were unpaired; of these:
14236834 (67.18%) aligned 0 times
5437800 (25.66%) aligned exactly 1 time
1518185 (7.16%) aligned >1 times

感觉没有变化，不知道为什么？

21192819 reads; of these:

21192819 (100.00%) were unpaired; of these:

14236838 (67.18%) aligned 0 times

5437793 (25.66%) aligned exactly 1 time

1518188 (7.16%) aligned >1 times

32.82% overall alignment rate

发表这个软件的文献本身也把这个软件跟其它软件做了详尽的对比

http://www.nature.com/nmeth/journal/v12/n4/full/nmeth.3317.html

Program Run time (min) Memory usage (GB)
Run times and memory usage for HISAT and other spliced aligners to align 109 million 101-bp RNA-seq reads from a lung fibroblast data set. We used three CPU cores to run the programs on a Mac Pro with a 3.7 GHz Quad-Core Intel Xeon E5 processor and 64 GB of RAM.
HISATx1 22.7 4.3
HISATx2 47.7 4.3
HISAT 26.7 4.3
STAR 25 28
STARx2 50.5 28
GSNAP 291.9 20.2
OLego 989.5 3.7
TopHat2 1,170 4.3

 

 

 

参考：http://www.plob.org/2015/03/20/8980.html

http://nextgenseek.com/2015/03/hisat-a-fast-and-memory-lean-rna-seq-aligner/

 

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