前面我分享了：最新最全的mutect2教程，提到了其实大家不必在一棵树上吊死，GATK的Mutect2流程跑不通就换一个软件咯，2018年文章：A review of somatic single nucleotide variant calling algorithms fornext-generation sequencing data 就囊括了十几款找somatic mutation的软件。当然了，绝大部分软件其实是没有尝试的价值。不过如果要是从安装和使用的简易性来考虑，varscan 软件必须值得一提。

我在生信技能树发布的很多关于varscan 软件找somatic mutation教程都过时了，如下：

• TCGA计划的4个找somatic mutation的软件使用体验
• 肿瘤全外显子测序数据分析流程大放送
• 肿瘤空间异质性探究

毕竟是三年多过去了。不过，varscan相比起GATK的Mutect2流程的更新频率来说，就是小巫见大巫了。正好我放弃了GATK的Mutect2流程，就使用varscan 软件找somatic mutation，我可以保证，这个教程应该是够用十年了，因为varscan 软件已经停止更新了。

背景知识

体细胞突变（somatic mutation）是指患者某些组织或者器官后天性地发生了体细胞变异，虽然它不会遗传给后代个体，却可以通过细胞分裂，遗传给子代细胞。体细胞突变对肿瘤的发生发展有关键性的作用，并且它也是制定肿瘤癌症靶向治疗措施的关键所在。

NGS使体细胞变异的检测更加全面，成本更低，在检测多种体细胞变异上具有很大的优势，但在使用过程中还存在着挑战：如样品降解、覆盖度不足、遗传异质性和组织污染（杂质)等问题。 为应对以上挑战，降低错误率，科学家采取了不同的算法和统计模型用于检测体细胞突变。目前最受欢迎的有Varscan、SomaticSniper、 Strelka 和MuTect2 。这些软件大都是直接对肿瘤-正常样本的每个位点进行比较，对肿瘤样本中明显高于正常样本的次等位基因进行标记，作为体细胞变异，同时排除种系突变和杂合性丢失（LOH）情况。虽然这些软件具有较高的引用率，并在不断地更新，但仍存在不足：

• a 、缺乏完整可靠的实验来评估检测结果；

• b、 缺乏金标准，不能保证检测到的灵敏度和特异性最高；

• c、 在实际应用中，各软件的相对优缺点在很大程度上是未知的。

下面是TCGA计划采取的体细胞突变（somatic mutation）检测软件：

• MuSE
• varscan
• MuTect
• SomaticSniper

大家可以去下载到TCGA计划的这4个软件输出的maf文件格式的somatic突变信息文件哦。

首先下载安装 varscan软件

软件发表在 2013 Dec 12. doi: 10.1002/0471250953.bi1504s44，文章标题是；Using VarScan 2 for Germline Variant Calling and Somatic Mutation Detection

软件本身功能有3个，如下 ：

不过，我们主要是看它的找somatic mutation模式，需要肿瘤病人配对的两个测序数据的bam文件哦。

肿瘤配对样品运行VarScan的

记住：需要肿瘤病人配对的两个测序数据的bam文件，这个是找somatic突变位点的前提条件。

我写了一个脚本方便批量运行，run_varscan.sh 脚本需要4个参数，运行起来很简单。

其中最重要的参数就是一个config文件，主要是3列信息：

• 第一列是肿瘤命名
• 第二列是肿瘤病人的normal组织的bam文件地址
• 第三列是肿瘤病人的肿瘤组织的bam文件地址。

这个config文件在我的run_varscan.sh 脚本的第2位参数上面，全部代码如下：

analysis_dir=$1
config_file=$2
number1=$3
number2=$4
# for i in {0..5};do ( nohup bash run_varscan.sh ./ config 6 $i 1>$i.log 2>&1 & );done 
# ps -ef |grep run_varscan.sh |awk '{print $2}' |xargs kill
reference=$HOME/biosoft/GATK/resources/bundle/mm10/Sequence/WholeGenomeFasta/genome.fa
# 不同物种的参考基因组不一样，在得到bam文件的时候就需要注意，一定要统一
cat $config_file |while read id
do
 arr=($id)
 normal_bam=${arr[1]}
 tumor_bam=${arr[2]}
 sample=${arr[0]}

 if((i%$number1==$number2))
 then
 # A1271-1_varscan.snp.Somatic.hc
 if [ ! -f ${sample}_varscan.snp.Somatic.hc.vcf ]; then

start=$(date +%s.%N)

echo VarScan `date`

normal_pileup="samtools mpileup -q 1 -f $reference $normal_bam";
 tumor_pileup="samtools mpileup -q 1 -f $reference $tumor_bam";
 # Next, issue a system call that pipes input from these commands into VarScan :
 java -jar ~/biosoft/VarScan/VarScan.v2.3.9.jar \
 somatic <($normal_pileup) <($tumor_pileup) ${sample}_varscan --output-vcf
 java -jar ~/biosoft/VarScan/VarScan.v2.3.9.jar processSomatic ${sample}_varscan.snp.vcf
 java -jar ~/biosoft/VarScan/VarScan.v2.3.9.jar processSomatic ${sample}_varscan.indel.vcf
 echo VarScan `date`
 dur=$(echo "$(date +%s.%N) - $start" | bc)
 printf "Execution time for VarScan : %.6f seconds" $dur
 echo

fi

fi
 i=$((i+1))

done

每个样品都会输出很多文件，但是其实我们最关心的仅仅是snp.Somatic.hc这个文件而已。 上面的代码看起来很复杂，但是抛开shell脚本后，软件用法其实就两句话，somatic命令+processSomatic命令而已。

到此为止，varscan 软件找somatic mutation的流程就完成啦。但是找到了somatic mutation仅仅是万里长征的第一步，后续如何去对找到的somatic mutation进行各种各样的注释才是重点。

vcf文件转为maf格式

对somatic mutation来说，vcf格式仅仅是开始，必须转为maf格式才能做后续分析。

这里推荐使用conda来安装vcf2maf和vep两个软件，代码如下：

conda create -n vep -y 
conda activate vep

conda install -y -c bioconda vcf2maf
conda install -y -c bioconda ensembl-vep
conda remove samtools
conda install -y -c bioconda samtools

vcf2maf.pl --hlep
vep --help 
samtools -v
perl -e '{print join"\n",@INC}'
export VEP_PATH=$HOME/vep
export VEP_DATA=$HOME/.vep
mkdir -p $VEP_PATH $VEP_DATA; cd $VEP_PATH

vep_install -a cf -s homo_sapiens -y GRCh38 -c $VEP_PATH --CONVERT

ref=$HOME/biosoft/GATK/resources/bundle/hg38/Homo_sapiens_assembly38.fasta
vcf2maf.pl --input-vcf T1520021_varscan.snp.Somatic.hc.vcf \
--output-maf test.maf --normal-id NORMAL --tumor-id TUMOR \
--ref-fasta $ref \
--vep-data $HOME/vep \
--vep-path ~/miniconda3/envs/vep/bin/ \
--ncbi-build GRCh38

如果是多个vcf文件，就需要写脚本批量运行啦。

附上TCGA数据库maf突变资料官方大全

因为TCGA计划跨时太长，这些年找somatic变异的软件也很多，所以TCGA团队下功夫在计划结束后（April 2018）完整的系统性的整理了最后的somatic突变数据。依托于文章：Scalable Open Science Approach for Mutation Calling of Tumor Exomes Using Multiple Genomic Pipelines March 201810.1016/j.cels.2018.03.002

纳入的软件包括：

全部样本的somatic变异文件合并起来是七百多M，MC3 Public MAF - mc3.v0.2.8.PUBLIC.maf.gz

• 下载链接是：https://api.gdc.cancer.gov/data/1c8cfe5f-e52d-41ba-94da-f15ea1337efc