看到单细胞转录组测序数据的文献：《Single-cell sequencing links multiregional immune landscapes and tissue-resident T cells in ccRCC to tumor topology and therapy efficacy》，是提供了配套数据， 所以，我下载了ccRCC_6pat_Seurat 文件，居然是26G，非常巨大！ 其降维聚类分群和生物学命名后，如下所示：
可以看到，主要是T淋巴细胞，和髓系淋巴细胞，少部分b淋巴细胞，部分内皮细胞和成纤维细胞，以及上皮细胞。尤其是T淋巴细胞的各个亚群，非常清晰，值得学习！
我仔细看了看那个26G的ccRCC_6pat_Seurat 文件，，发现是旧版本的seurat对象，所以使用了下面的代码进行转换：
rm(list=ls())
options(stringsAsFactors = F)
library(Seurat)
sce=readRDS('ccRCC_6pat_Seurat')
sce
sce=UpdateSeuratObject(sce)
sce
DimPlot(sce)
save(sce,file = 'first_sce.Rdata')
关键就是 UpdateSeuratObject 函数啦！我看了看，存储后的文件，就1个G啦，非常棒！
看了看这个对象里面的元素应有尽有，可以直接绘图如下：
降维聚类分群都OK了，接下来就是根据背景知识对这些细胞亚群进行生物学命名啦！
但是使用基因名字去可视化各个亚群，全部报错，因为它的基因居然是ensemb 数据库的ID ，并不是我们常见的基因symbol ：
> head(rownames(sce))
[1] "ENSG00000237683" "ENSG00000228463" "ENSG00000225880" "ENSG00000230368" "ENSG00000187634"
[6] "ENSG00000188976"
需要做一个转换，下面演示一下这个步骤：
首先拿到基因转换列表：
rm(list=ls())
library(Seurat)
load(file = 'first_sce.Rdata')
sce # 16323 features
library(org.Hs.eg.db)
head(rownames(sce))
ids=select(org.Hs.eg.db,keys = rownames(sce),
columns = c('ENSEMBL','SYMBOL'),
keytype = 'ENSEMBL')
head(ids)
dim(ids) # [1] 16428
ids=na.omit(ids)
dim(ids) # [1] 15504
length(unique(ids$SYMBOL)) # [1] 15494
# 这里的关系超级乱，互相之间都不是一对一
# 凡是混乱的ID一律删除即可
ids=ids[!duplicated(ids$SYMBOL),]
ids=ids[!duplicated(ids$ENSEMBL),]
pos=match(ids$ENSEMBL,rownames(sce) )
sce=sce[pos,]
sce # 15393 features
# rownames(sce) = ids$SYMBOL
本来是准备使用 rownames(sce) = ids$SYMBOL 搞定这个 seurat对象的基因名字转换，但是失败了。
略微搜索了一下，https://github.com/satijalab/seurat/issues/2617 提到了一个函数：
# https://github.com/satijalab/seurat/issues/2617
# RenameGenesSeurat ------------------------------------------------------------------------------------
RenameGenesSeurat <- function(obj ,
newnames ) {
# Replace gene names in different slots of a Seurat object. Run this before integration. Run this before integration.
# It only changes obj@assays$RNA@counts, @data and @scale.data.
print("Run this before integration. It only changes obj@assays$RNA@counts, @data and @scale.data.")
RNA <- obj@assays$RNA
if (nrow(RNA) == length(newnames)) {
if (length(RNA@counts)) RNA@counts@Dimnames[[1]] <- newnames
if (length(RNA@data)) RNA@data@Dimnames[[1]] <- newnames
if (length(RNA@scale.data)) RNA@scale.data@Dimnames[[1]] <- newnames
} else {"Unequal gene sets: nrow(RNA) != nrow(newnames)"}
obj@assays$RNA <- RNA
return(obj)
}
obj=RenameGenesSeurat(obj = sce,
newnames = ids$SYMBOL)
save(sce,file = 'first_sce.Rdata')
蛮简单的，接下来就可以继续可视化啦！
# T Cells (CD3D, CD3E, CD8A),
# B cells (CD19, CD79A, MS4A1 [CD20]),
# Plasma cells (IGHG1, MZB1, SDC1, CD79A),
# Monocytes and macrophages (CD68, CD163, CD14),
# NK Cells (FGFBP2, FCG3RA, CX3CR1),
# Photoreceptor cells (RCVRN),
# Fibroblasts (FGF7, MME),
# Endothelial cells (PECAM1, VWF).
# epi or tumor (EPCAM, KRT19, PROM1, ALDH1A1, CD24).
# immune (CD45+,PTPRC), epithelial/cancer (EpCAM+,EPCAM),
# stromal (CD10+,MME,fibo or CD31+,PECAM1,endo)
library(ggplot2)
genes_to_check = c('PTPRC', 'CD3D', 'CD3E', 'CD4','CD8A','CD19', 'CD79A', 'MS4A1' ,
'IGHG1', 'MZB1', 'SDC1',
'CD68', 'CD163', 'CD14',
'TPSAB1' , 'TPSB2', # mast cells,
'RCVRN','FPR1' , 'ITGAM' ,
'FGF7','MME', 'ACTA2',
'PECAM1', 'VWF',
'EPCAM' , 'KRT19', 'PROM1', 'ALDH1A1' )
library(stringr)
p_all_markers <- DotPlot(sce , features = genes_to_check,
assay='RNA' ) + coord_flip()
p_all_markers
ggsave(plot=p_all_markers, filename="check_all_marker_by_seurat_cluster.pdf")
可以很明显的看到：
我们做肿瘤研究的单细胞数据，一般来说会选择初步很粗狂的定义大的细胞亚群，比如我常用的 第一次分群是通用规则是：
- immune (CD45+,PTPRC),
- epithelial/cancer (EpCAM+,EPCAM),
- stromal (CD10+,MME,fibo or CD31+,PECAM1,endo)
根据上面的标记基因列表，我给出来的亚群是：
# 需要自行看图，定细胞亚群：
celltype=data.frame(ClusterID=0:34,
celltype='unkown')
celltype[celltype$ClusterID %in% c( 0,2:4,6:8,10,15,17,17,19,31,32),2]='Tcells'
celltype[celltype$ClusterID %in% c( 24 ),2]='plasma'
celltype[celltype$ClusterID %in% c( 22 ),2]='naive-Bcells'
celltype[celltype$ClusterID %in% c(21),2]='mast'
celltype[celltype$ClusterID %in% c( 1,5,12:14,18,23,27,33,34),2]='myeloid'
celltype[celltype$ClusterID %in% c( 9,16,26 ),2]='epithelial'
celltype[celltype$ClusterID %in% c( 11),2]='endo'
celltype[celltype$ClusterID %in% c(20),2]='fibo'
celltype[celltype$ClusterID %in% c(25 ),2]='SMC'
head(celltype)
celltype
table(celltype$celltype)
出图如下：
之所以我们有一堆unknown，是因为我对这个ccRCC的肿瘤并不熟悉，我的背景认知就是3个大亚群！前面的例子：人人都能学会的单细胞聚类分群注释 ，我们演示了第一层次的分群。
如果你对单细胞数据分析还没有基础认知，可以看基础10讲：