10x官网下载pbmc3k的bam文件走定量流程

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最近各个交流群总是看到大家询问一些单细胞公共数据集处理，居然是从bam文件开始，可能是因为都是从ENA数据库下载吧。

比如文章：《Defining the emergence of myeloid-derived suppressor cells in breast cancer using single-cell transcriptomics》，其数据在 https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJNA578550?show=reads ：

可以看到这个研究就两个样品，一个有fastq文件，一个是bam文件，非常的诡异，想下载其数据进行二次使用还很考验技术哦 ：

Droplet Based Single Cell RNA sequencing libraries were generated for 5 pooled FVB/n mouse spleens and 3 pooled PYMT mouse spleens using the 10x Genomics Chromium Platform and sequenced on the Illumina HighSeq 4000

其实这个bam文件就是标准的cellranger流程拿到的，其实目前单细胞转录组以10X公司为主流，我们也是在单细胞天地公众号详细介绍了cellranger全部使用细节及流程，大家可以自行前往学习，如下：

但是这个两年前的系列笔记是基于V2,V3版本的cellranger，在2020的7月我看到了其更新到了V4，也里面写了一个总结，见：cellranger更新到4啦（全新使用教程）

10x官网下载pbmc3k的bam文件

因为恰好最近也需要pbmc3k的bam文件做RNA速率分析，所以就选择10x官网下载pbmc3k的bam文件作为案例给大家演示。

链接在这 https://www.10xgenomics.com/resources/datasets/3-k-pbm-cs-from-a-healthy-donor-1-standard-1-1-0

我们可以选择下载fq或者bam文件，由于pbmc3k是v1试剂时期的产物，他的fq文件比较古老。

其实10x官网的pbmc3k有fq文件，包含了多条lane，这里我们就不修改fq文件名了，因为可以直接下载bam文件，然后转换成fq的。

bamtofastq软件安装

首先我们要下载bamtofastq软件 ， 根据自己的操作 系统选择版本。https://support.10xgenomics.com/docs/bamtofastq#header

wget -c https://github.com/10XGenomics/bamtofastq/releases/download/v1.4.1/bamtofastq_linux
chmod +x bamtofastq_linux
./bamtofastq_linux --help
# bamtofastq v1.4.1
# 10x Genomics BAM to FASTQ converter.

这个bamtofastq软件 小工具，参数还是蛮多的：

Usage:
  bamtofastq [options] <bam> <output-path>
  bamtofastq (-h | --help)
​
Options:
​
  --nthreads=<n>        Threads to use for reading BAM file [default: 4]
  --locus=<locus>       Optional. Only include read pairs mapping to locus. Use chrom:start-end format.
  --reads-per-fastq=N   Number of reads per FASTQ chunk [default: 50000000]
  --relaxed             Skip unpaired or duplicated reads instead of throwing an error.
  --gemcode             Convert a BAM produced from GemCode data (Longranger 1.0 - 1.3)
  --lr20                Convert a BAM produced by Longranger 2.0
  --cr11                Convert a BAM produced by Cell Ranger 1.0-1.1
  --bx-list=L           Only include BX values listed in text file L. Requires BX-sorted and index BAM file (see Long Ranger support for details).
  --traceback           Print full traceback if an error occurs.
  -h --help             Show this screen.

接下来运行bamtofastq，需要注意的是 --cr11 参数哦，其实bam文件里面有其来源的软件版本和命令：

./bamtofastq_linux --cr11 pbmc3k_possorted_genome_bam.bam ./fastqs

得到fastq文件，如下所示:

tree fastqs/
fastqs/
└── gemgroup001
    ├── bamtofastq_S1_L000_I1_001.fastq.gz
    ├── bamtofastq_S1_L000_I1_002.fastq.gz
    ├── bamtofastq_S1_L000_I1_003.fastq.gz
    ├── bamtofastq_S1_L000_I1_004.fastq.gz
    ├── bamtofastq_S1_L000_R1_001.fastq.gz
    ├── bamtofastq_S1_L000_R1_002.fastq.gz
    ├── bamtofastq_S1_L000_R1_003.fastq.gz
    ├── bamtofastq_S1_L000_R1_004.fastq.gz
    ├── bamtofastq_S1_L000_R2_001.fastq.gz
    ├── bamtofastq_S1_L000_R2_002.fastq.gz
    ├── bamtofastq_S1_L000_R2_003.fastq.gz
    ├── bamtofastq_S1_L000_R2_004.fastq.gz
    ├── bamtofastq_S1_L000_R3_001.fastq.gz
    ├── bamtofastq_S1_L000_R3_002.fastq.gz
    ├── bamtofastq_S1_L000_R3_003.fastq.gz
    └── bamtofastq_S1_L000_R3_004.fastq.gz

下面就可以基于上面的fastq文件，可以重新来运行 cellranger count了，也是超级简单 :

db=/home/bakdata/x10/pipeline/refdata-gex-GRCh38-2020-A
bin=/home/bakdata/x10/pipeline/cellranger-6.1.2/bin
$bin/cellranger count --id=pbmc3k \
--fastqs=./fastqs/gemgroup001 \
--transcriptome=$db \
--expect-cells=3000

这个时候的cellranger count又会产生bam文件，不过如果我们不需要做RNA速率分析，其实就无所谓了，关键是可以产生表达量矩阵文件。

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