大家都知道，这十几年来最流行的差异分析软件就是R的limma包了，但是它以前只支持microarray的表达数据。

考虑到大家都熟悉了它，它又发了一个voom的方法，让它从此支持RNA-seq的count数据啦！

大家都知道芯片数据跟RNA-seq数据的本质就是value的分布不一样，所以各种针对RNA-seq的差异分析包也就是提出来一个新的normalization方法而已。

而我们limma本身就提出了一个voom的方法来对RNA-seq数据进行normalization

使用这个包也需要三个数据：

用法与limma一模一样的，只是多了一个normalization而已。

读取自己的数据

一般我们会自己读取表达矩阵和分组信息，下面是一个例子：

options(warn=-1)
suppressMessages(library(DESeq2))
suppressMessages(library(limma))
suppressMessages(library(pasilla))
data(pasillaGenes)
exprSet=counts(pasillaGenes)
head(exprSet)  ##表达矩阵如下
##             treated1fb treated2fb treated3fb untreated1fb untreated2fb
## FBgn0000003          0          0          1            0            0
## FBgn0000008         78         46         43           47           89
## FBgn0000014          2          0          0            0            0
## FBgn0000015          1          0          1            0            1
## FBgn0000017       3187       1672       1859         2445         4615
## FBgn0000018        369        150        176          288          383
##             untreated3fb untreated4fb
## FBgn0000003            0            0
## FBgn0000008           53           27
## FBgn0000014            1            0
## FBgn0000015            1            2
## FBgn0000017         2063         1711
## FBgn0000018          135          174
(group_list=pasillaGenes$condition)
## [1] treated   treated   treated   untreated untreated untreated untreated
## Levels: treated untreated
##这是分组信息，7个样本，3个处理的，4个未处理的对照！

另外一个例子是从airway里面得到表达矩阵和分组信息

library(airway)
data(airway)
exprSet=assays(airway)$counts  ## 表达矩阵
group_list=colData(airway)$dex ## 分组信息

第一步：构建分组矩阵

suppressMessages(library(limma))
design <- model.matrix(~factor(group_list))
colnames(design)=levels(factor(group_list))
rownames(design)=colnames(exprSet)
design
##              treated untreated
## treated1fb         1         0
## treated2fb         1         0
## treated3fb         1         0
## untreated1fb       1         1
## untreated2fb       1         1
## untreated3fb       1         1
## untreated4fb       1         1
## attr(,"assign")
## [1] 0 1
## attr(,"contrasts")
## attr(,"contrasts")$`factor(group_list)`
## [1] "contr.treatment"

第二步：根据分组信息和表达矩阵进行normalization

这里构建了一个对象 An object of class “EList”

v <- voom(exprSet,design,normalize="quantile")
## 下面的代码如果你不感兴趣不需要运行，免得误导你
## 就是看看normalization前面的数据分布差异
#png("RAWvsNORM.png")
exprSet_new=v$E
par(cex = 0.7)
n.sample=ncol(exprSet)
if(n.sample>40) par(cex = 0.5)
cols <- rainbow(n.sample*1.2)
par(mfrow=c(2,2))
boxplot(exprSet, col = cols,main="expression value",las=2)
boxplot(exprSet_new, col = cols,main="expression value",las=2)
hist(exprSet)
hist(exprSet_new)

#dev.off()

可以很明显看到normalization前后数据分布差异非常大！

第三步：做差异分析，提取差异分析结果

这里不需要差异比较矩阵了，因为我的分组矩阵表明样本就分成两组，直接提取coef=2的数据即可

fit <- lmFit(v,design)
fit2 <- eBayes(fit)
tempOutput = topTable(fit2, coef=2, n=Inf)
DEG_voom = na.omit(tempOutput)
head(DEG_voom)
##                  logFC  AveExpr         t      P.Value    adj.P.Val
## FBgn0029167  2.1608689 7.880589  41.19142 5.195806e-08 0.0007518331
## FBgn0003137 -0.9560776 8.421903 -29.97211 2.920473e-07 0.0021129620
## FBgn0003748 -1.0385933 6.395990 -23.78787 1.020682e-06 0.0049230892
## FBgn0035085  2.5190255 5.221183  21.01339 1.993995e-06 0.0058809216
## FBgn0050185 -0.4886279 5.487547 -19.95422 2.635106e-06 0.0058809216
## FBgn0015568 -1.1040979 3.922438 -19.96954 2.624231e-06 0.0058809216
##                    B
## FBgn0029167 9.065020
## FBgn0003137 7.800063
## FBgn0003748 6.652695
## FBgn0035085 5.870585
## FBgn0050185 5.734162
## FBgn0015568 5.557560

差异分析结果就不解释啦！