YGC是我非常喜欢的一个博客，但是之前都是英文，所以我没怎么看，余老师还在R领域很有建树，个人发表了5个R在生信方面的包，我后面有空会一个个试用学习。

本文转自http://ygc.name/2014/08/27/insertion-size/

里面详细解释了NGS测序的几个基本概念，也是我之前一直弄混淆的概念，包括插入片段、单端测序，双端测序，配对测序，contig，scaffold等等

在进行测序的时候，需要将DNA打断，构建library，这些fragment需要接上adaptor，好进行扩增，illumina的测序，可以有single end和paired end两种，分别从一端和两端进行测序。

fragment                  ========================================
fragment + adaptors    ~~~========================================~~~
SE read                   --------->
PE reads                R1--------->                    <---------R2
unknown gap                         ....................

insertion并不是指R1和R2之间的unknown gap，早在NGS之前，当我们在使用ecoli构建载体的时候，这个概念就已经形成，它是adaptors之间的序列。而unknown gap则称之为inner mate：

PE reads      R1--------->                    <---------R2
fragment     ~~~========================================~~~
insert          ========================================
inner mate                ....................

显然我们不希望看到大量的unknown gap，所以要制造短的fragment，而且技术不断发展，测序长度也越来越长，于是可以测通fragment：

fragment          ~~~========================================~~~
insert               ========================================
R1                   ------------------------->                    
R2                                   <-----------------------
overlap                              ::::::::::
stitched SE read     --------------------------------------->

这样R1和R2就有overlap，合并一致序列，就可以得到完整的fragment，使用短的fragment，也就是insertion size比较小的library，测序的结果coverage比较大，因为我们可以测通fragment.

虽然adaptor不会被测序，但如果fragment太短，被读通了，则另一端的adaptor就会被测到。

tiny fragment       ~~~~========================~~~~
insert                  ========================
R1                      -------------------------->                    
R2                   <--------------------------
read-through         !!!                        !!!

如果MiSeq设置正确的话，读通的adaptor是会被切除了，这样就会获得长度不一致的short reads，也可以使用N来替换adaptor序列，这样长度一样，但会在5' end看到很多N。如果没设置好，reads里含有adaptor序列，那么必须要通过软件去除，否则后续的分析都会有问题。

所以insertion size小有个好处，测序的genome coverage高，但是在进行de novo assembly的时候，有一个问题，如果基因组含有比read length还要长的重复元件时，就无法拼接，所以得到的是很多的contigs，它们之间的gap要长于insertion size且无法确定。这个问题是相当普遍的，即使是相对简单的ecoli基因组，也有一定数量的重复元件。

这个问题需要使用大的insertion size进行paired end测序来解决。

fragment + adaptors    ~~~========================================~~~
PE reads                R1--------->                    <---------R2
unknown gap                         ....................

在这种insertion size比较大的情况下，我们可以估计R1和R2之间的距离，只要有一个片段能够被mapped到unique position的话，那么另一个片段的大致位置就可以确定。所以为了达到好的拼接效果，长fragment的library也是必须的，它有可能给出 contigs间的相对位置。

所以理想的情况是使用multiple insert libraries，short-insert library可以保证获得足够的coverage，它可以告诉你contigs之间的序列，但信息是local的，它没办法告诉你怎么拼；而long- insert libary则可以告诉你一些相对global的信息。

在上面这个测试的数据中，加了long-insert libary虽然在coverage上没多少变化，但N50和最大的contig都显著提高，4.5Mb已经覆盖了~98%的ecoli基因组。

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