九 02

热图到底是横向基因层面归一化还是依据纵向的样品呢？

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看到了一个2022的文章，标题是：《Bromodomain Inhibitors Modulate FcgR-Mediated Mononuclear Phagocyte Activation and Chemotaxis》。这个研究里面的转录组数据是通过RNA测序（RNA-seq）技术获得的，这些数据来自两个不同的细胞类型：树突细胞（Dendritic Cells, DCs）和巨噬细胞（Macrophages），以及它们在不同实验条件下的反应。 Continue reading →

九 02

欧美我来啦！

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其实已经在朋友圈多次宣告过我要前往欧美，主要就是想拖家带口的换个环境生活，这个是最高目标。
这个也是我这么多年坚持把博士学位修完的唯一目的：拥有环游世界的旅居生活的主动权！ Continue reading →

九 02

你的肿瘤单细胞肿瘤数据能区分这7种巨噬细胞吧

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刷到了一个2022的巨噬细胞相关的单细胞综述文章：《Macrophage diversity in cancer revisited in the era of single-cell omics》，这篇综述文章深入探讨了肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-Associated Macrophages, TAMs）的单细胞亚群，并根据其特征基因、富集通路及潜在功能，将TAMs分为7个不同的亚群。 Continue reading →

九 02

可以每一条代谢通路都激活吗

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最近刷到了2023发表在NC杂志的男性乳腺癌患者的单细胞转录组图谱文章，标题是：《Single-cell transcriptome analysis indicates fatty acid metabolism-mediated metastasis and immunosuppression in male breast cancer》

其中附件有一张图是男性和女性的乳腺癌患者肿瘤细胞表达量差异基因的代谢通路打分后的差异热图，如下所示： Continue reading →

九 02

流式细胞都删不掉的亚群有什么特殊之处吗

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前面我们分享了流式细胞这个技术在单细胞转录组课题的应用，详见：流式细胞筛选能保证多大程度的细胞亚群纯度呢，也就是说其实它并不能保证我们百分百获取的都是目标单细胞亚群从而对它进行细致的 探索。这一点也是大家总是在微信交流群提问，我才特意整理的： Continue reading →

九 02

间充质细胞的细分亚群情况

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我在内皮细胞的细分亚群情况里面提到了，肿瘤微环境里面的stromal不仅仅是 fibro 和endo，还有周细胞和SMC，不过大多数情况下肿瘤样品里面的基质细胞并不多，所以不一定能细分清楚。其中内皮细胞主要是区分成为了淋巴内皮和血管内皮， 其中血管可以细分为动脉静脉和毛细血管： Continue reading →

九 02

换一个技术工具结果就完全不同的RNA速率分析你还敢用吗

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看到了一个预印本的文章：《Challenges and Progress in RNA Velocity: Comparative Analysis Across Multiple Biological Contexts，值得单细胞技术领域的小伙伴们深刻反思：因为测评后发现五大RNA速率计算方法结果迥异，这可能会对细胞状态动态的理解产生重要影响。文献详见 doi: https://doi.org/10.1101/2024.06.25.600667

单细胞转录组里面的RNA速率分析重要性 Continue reading →

九 02

二十多万个细胞的单细胞数据集当然是继续顶啊

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前面我在 十多万个细胞数量就顶不住了吗提到了一个关键的转换， 稀疏矩阵：

ct <- as.matrix(ct, type="dgCMatrix")

马上交流群就有小伙伴反馈了同款的bug，是二十多万个细胞的单细胞数据集，但是他自己就算是转换成为稀疏矩阵也没有解决问题。。。

# 参考：https://mp.weixin.qq.com/s/tw7lygmGDAbpzMTx57VvFw
ct=data.table::fread('GSE183852_Integrated_Counts.csv.gz',
 data.table = F) 
ct[1:4,1:4]
tail(ct[ ,1:4])
rownames(ct)=ct[,1] 
ct=ct[,-1]

tmp <- as.matrix(ct, type="dgCMatrix")
sce.all=CreateSeuratObject(counts = tmp )

如下所示：

> ct[1:4,1:4]
 gene H_ZC-11-292_TAAGTGCAGCAGGTCA H_ZC-11-292_ACAGCCGGTCATACTG
1 RP11-34P13.3 0 0
2 FAM138A 0 0
3 OR4F5 0 0
4 RP11-34P13.7 0 0 
> tail(ct[ ,1:4])
 gene H_ZC-11-292_TAAGTGCAGCAGGTCA
45063 AC136352.3 0
45064 AC136352.2 0
45065 AC171558.3 0
45066 BX004987.1 0
45067 AC145212.1 0
45068 MAFIP 0
Warning: Data is of class matrix. Coercing to dgCMatrix.
Error: vector memory exhausted (limit reached?)

我也确实是在我们的共享服务器（2024的共享服务器交个朋友福利价仍然是800）测试了，发现并没有问题。就继续沟通，发现交流群的小伙伴其实还没有使用我们的超大内存服务器，仅仅是在自己的电脑里面跑这个代码，所以失败完全是理所当然啊！！！

但是，问题还是得为他解决，上面的GSE183852数据集是有接近27万个细胞，所以绝大部分人普通电脑很难跑通这个环节，很正常。

我做了一个简单的磁盘中间环节避免这个内存bug，如下所示：

 lapply(0:8, function(i){
 # i=1
 print(i)
 kp= seq(1,ncol(ct)) %in% seq(i*30000 ,(i+1)*30000)
 print(table(kp))
 tmp= ct[,kp] 
 tmp=as.matrix( tmp , 
 type="dgCMatrix") 
 save(tmp,file = paste(i,'tmp.Rdata'))
 })

也就是说，GSE183852数据集是有接近27万个细胞，我把它拆分成为了9个独立的3万个细胞的表达量矩阵文件并且存储在硬盘里面。

然后就可以关闭R后重新打开，进行批量读取：

 library(Seurat)
 sceList = lapply(0:8, function(i){
 # i=1
 print(i)
 load(file = paste(i,'tmp.Rdata'))
 print(dim(tmp))
 sce =CreateSeuratObject(counts = tmp,
 #project = i ,
 min.cells = 5,
 min.features = 300 )
 print(sce)
 return(sce)
 })

 sce.all=merge(x=sceList[[1]],
 y=sceList[ -1 ] ) 
 names(sce.all@assays$RNA@layers)
 sce.all[["RNA"]]$counts 
 # Alternate accessor function with the same result
 LayerData(sce.all, assay = "RNA", layer = "counts")
 sce.all <- JoinLayers(sce.all)
 dim(sce.all[["RNA"]]$counts )

当然了，如果是你有服务器（2024的共享服务器交个朋友福利价仍然是800），就没必要上面的这样的如此曲折的分析了。

接下来就可以进行常规的降维聚类分群哈， 如下所示的初步结果：

初步结果

基本上可以看到下面的这些亚群是可以手动命名的：

 celltype[celltype$ClusterID %in% c( 6 ),2]='lymphocytes' 
 celltype[celltype$ClusterID %in% c( 3 ),2]='myeloids' 
 celltype[celltype$ClusterID %in% c( 1,5 ),2]='endo' 
 celltype[celltype$ClusterID %in% c( 8 ),2]='L-endo' 
 celltype[celltype$ClusterID %in% c( 9 ),2]='epi'
 celltype[celltype$ClusterID %in% c( 0 ),2]='fibro'
 celltype[celltype$ClusterID %in% c( 4 ),2]='SMC' 
 celltype[celltype$ClusterID %in% c( 10 ),2]='Mast' 
 celltype[celltype$ClusterID %in% c( 12 ),2]='double'

然后需要看文章里面的基因列表：

image-20240813214836837

补充进行可视化：

 cg='RYR2 MYH11 DCN VWF CCL21 NRXN1 HAS1 KIT MZB1 PLIN1 C1QC KCNJ8 LEPR CD3E'
 gene_list=trimws(strsplit(cg,' ')[[1]])
 gene_list
 p2 = DotPlot( sce.all.int, features = gene_list, 
 group.by = 'RNA_snn_res.0.1') + 
 theme(axis.text.x = element_text(angle = 45, vjust = 0.5, hjust=0.5))
 p2 
 ggsave('heart-0.1.pdf',width=8)

就可以继续给名字


celltype[celltype$ClusterID %in% c(11 ),2]='Adipo' 
 celltype[celltype$ClusterID %in% c( 7 ),2]='Neuron' 
 celltype[celltype$ClusterID %in% c( 2 ),2]='CM'

最后的效果，我感觉我做的比文章要好一点，哈哈哈，如下所示：

做的比文章要好一点

学徒作业

首先呢，完成上面的GSE183852数据集 接近27万个细胞的降维聚类分群和命名，然后读一下文章：《Single-cell transcriptomics reveals cell-type- specific diversification in human heart failure》，然后做一个简单的差异分析即可：

Differential expression analy- sis by pseudobulk and single-cell approaches across disease state revealed a large number of genes significantly upregulated (NPPA, NPPB, ACE2 and KIF13A) and downregulated (MYH6, ADRB2 and CKM) in DCM samples compared to non-diseased donors

并且绘制如下所示的差异基因的热图：

差异基因的热图

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