经过前面的CHIP-seq测序数据处理的常规分析，我们已经成功的把测序仪下机数据变成了BED格式的peaks记录文件，我选取的这篇文章里面做了4次CHIP-seq实验，分别是两个重复的野生型MCF7细胞系的 BAF155 immunoprecipitates和两个重复的突变型MCF7细胞系的 BAF155 immunoprecipitates，这样通过比较野生型和突变型MCF7细胞系的 BAF155 immunoprecipitates的结果的不同就知道该细胞系的BAF155 突变，对它在全基因组的结合功能的影响啦。
#我这里直接从GEO里面下载了peaks结果，它们详情如下：wc -l *bed
6768 GSM1278641_Xu_MUT_rep1_BAF155_MUT.peaks.bed
3660 GSM1278643_Xu_MUT_rep2_BAF155_MUT.peaks.bed
11022 GSM1278645_Xu_WT_rep1_BAF155.peaks.bed
5260 GSM1278647_Xu_WT_rep2_BAF155.peaks.bed
49458 GSM601398_Ini1HeLa-peaks.bed
24477 GSM601398_Ini1HeLa-peaks-stringent.bed
12725 GSM601399_Brg1HeLa-peaks.bed
12316 GSM601399_Brg1HeLa-peaks-stringent.bed
46412 GSM601400_BAF155HeLa-peaks.bed
37920 GSM601400_BAF155HeLa-peaks-stringent.bed
30136 GSM601401_BAF170HeLa-peaks.bed
25432 GSM601401_BAF170HeLa-peaks-stringent.bed
每个BED的peaks记录，本质是就3列是需要我们注意的，就是染色体，以及在该染色体上面的起始和终止坐标，如下：
#PeakID chr start end strand Normalized Tag Count region size findPeaks Score Clonal Fold Change
chr20 52221388 52856380 chr20-8088 41141 +
chr20 45796362 46384917 chr20-5152 31612 +
chr17 59287502 59741943 chr17-2332 29994 +
chr17 59755459 59989069 chr17-667 19943 +
chr20 52993293 53369574 chr20-7059 12642 +
chr1 121482722 121485861 chr1-995 9070 +
chr20 55675229 55855175 chr20-6524 7592 +
chr3 64531319 64762040 chr3-4022 7213 +
chr20 49286444 49384563 chr20-4482 6165 +
我们所谓的peaks注释，就是想看看该peaks在基因组的哪一个区段，看看它们在各种基因组区域(基因上下游，5,3端UTR，启动子，内含子，外显子，基因间区域，microRNA区域)分布情况，但是一般的peaks都有近万个，所以需要批量注释，如果脚本学的好，自己下载参考基因组的GFF注释文件，完全可以自己写一个，我这里会介绍一个R的bioconductor包ChIPpeakAnno来做CHIP-seq的peaks注释，下面的包自带的示例：
library(ChIPpeakAnno)
bed <- system.file("extdata", "MACS_output.bed", package="ChIPpeakAnno")
gr1 <- toGRanges(bed, format="BED", header=FALSE)
## one can also try import from rtracklayer
library(rtracklayer)
gr1.import <- import(bed, format="BED")
identical(start(gr1), start(gr1.import))
gr1[1:2]
gr1.import[1:2] #note the name slot is different from gr1
gff <- system.file("extdata", "GFF_peaks.gff", package="ChIPpeakAnno")
gr2 <- toGRanges(gff, format="GFF", header=FALSE, skip=3)
ol <- findOverlapsOfPeaks(gr1, gr2)
makeVennDiagram(ol)##还可以用binOverFeature来根据特定的GRanges对象(通常是TSS)来画分布图
## Distribution of aggregated peak scores or peak numbers around transcript start sites.
可以看到这个包使用起来非常简单，只需要把我们做好的peaks文件(GSM1278641_Xu_MUT_rep1_BAF155_MUT.peaks.bed等等)用toGRanges或者import读进去，成一个GRanges对象即可，上面的代码是比较两个peaks文件的overlap。然后还可以根据R很多包都自带的数据来注释基因组特征：
data(TSS.human.GRCh37) ## 主要是借助于这个GRanges对象来做注释，也可以用getAnnotation来获取其它GRanges对象来做注释
## featureType ： TSS, miRNA, Exon, 5'UTR, 3'UTR, transcript or Exon plus UTR
peaks=MUT_rep1_peaks
macs.anno <- annotatePeakInBatch(peaks, AnnotationData=TSS.human.GRCh37,
output="overlapping", maxgap=5000L)## 得到的macs.anno对象就是已经注释好了的，每个peaks是否在基因上，或者距离基因多远，都是写的清清楚楚
if(require(TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene)){
aCR<-assignChromosomeRegion(peaks, nucleotideLevel=FALSE,
precedence=c("Promoters", "immediateDownstream",
"fiveUTRs", "threeUTRs",
"Exons", "Introns"),
TxDb=TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene)
barplot(aCR$percentage)
}
得到的条形图如下，虽然很丑，但这就是peaks注释的精髓，搞清楚每个peaks在基因组的位置特征：
同理，对每个peaks文件，都可以做类似的分析！
但是对多个peaks文件，比如本文中的，想比较野生型和突变型MCF7细胞系的 BAF155 immunoprecipitates的结果的不同，就需要做peaks之间的差异分析，已经后续的差异基因注释啦
当然，值得一提的是peaks注释我更喜欢网页版工具，反正peaks文件非常小，直接上传到别人做好的web tools，就可立即出一大堆可视化图表分析结果啦，大家可以去试试看：
BayesPeak也是peaks caller家族一员，用的人也不少，我这次也试了一下，因为是R的bioconductor系列包，所以直接在R里面安装就好，但是有几个点需要注意，我比对的基因组不只是Chr1~22,X,Y,M，还有一些contig和scaffold，需要在bam文件里面去除的，而且BayesPeak比较支持读取BED文件，可以直接转为GRanges对象，虽然它号称可以使用多核，但是计算速度还是非常慢。 Continue reading
此文专门讲这个软件如何用，但是跟我以前写的软件说明书又不大一样，主要是因为我用MACS2这个软件call peaks并没有达到预期的结果，所以就多使用了几个软件，其中PeakRanger尤其值得一提，安装特别简单，而且处理数据的速度特别快，结果也非常容易理解，更重要的是它给出一个网页版的报告，里面有所有找到的符合要求的peaks的可视化图片！！！！ Continue reading
